Detalyadong agglutination reaction (RA). Tinatayang agglutination reaction (RA)
Mga reaksyon ng immune. Application ng immune reactions sa diagnosis ng mga nakakahawang sakit.
PLANO:
Mga uri ng mga reaksyon ng immune.
Mga kondisyon para sa pagsasagawa ng serological reaksyon.
Mga kinakailangan sa suwero.
Ang konsepto ng positibo at negatibong mga resulta.
PANGUNAHING NILALAMAN:
Mga uri ng mga reaksyon ng immune.
Reaksyon ng immunological – Ito ang pakikipag-ugnayan ng isang antigen sa isang antibody, na tinutukoy ng partikular na pakikipag-ugnayan ng mga aktibong sentro ng antibody (paratope) sa mga epitope ng antigens.
Pangkalahatang pag-uuri ng mga reaksiyong immunological:
serological reaksyon – reaksyon sa pagitan ng antigens (Ag) at antibodies (Ig)
sa vitro ;
mga reaksyon ng cellular kasama ang pakikilahok ng mga immunocompetent na selula;
mga pagsusuri sa allergy - pagtuklas ng hypersensitivity.
Mga serological na reaksyon: 1) kahulugan, 2) mga yugto, 3) mga layunin, 4) pangkalahatang pag-uuri.
1) Kahulugan
Mga pamamaraan ng serological na pananaliksik (mula sa Latin Serum - serum at logos - pag-aaral) gamit ang reaksyon ng antigen-antibody.
2) Mga yugto
2 yugto ng pakikipag-ugnayan:
ako. Tukoy (nakikita) – mabilis na nangyayari, ang mga antibodies ay nagsasama sa kanilang mga katumbas na antigens. Sa yugtong ito, nakikipag-ugnayan ang mga determinant na grupo ng antigens (AG) at mga aktibong sentro ng antibodies (AT).
Ang mga puwersang kasangkot sa pagbuo ng AG + AT complex ay:
palawit;
van der Waals
Mga bono ng hydrogen.
Walang nakikitang pagbabago sa yugtong ito. Ipinapakita ng electron microscopy ang AG+AT complex sa anyo ng isang sala-sala.
II. Nonspecific – nangyayari nang dahan-dahan, ang nagreresultang antigen-antibody complex ay tumutugon sa isang karagdagang nonspecific environmental factor kung saan nangyayari ang reaksyon, at ito ay nakikita ng mata – gluing, dissolution, precipitation flakes, atbp. Sa pagkakaroon ng electrolyte, bumababa ang singil , bumababa ang solubility, nabubuo ang mga nakikitang conglomerates , namumuo (agglutinate).
3) Pagtatakda ng mga layunin :
a) upang matukoy ang antigen (kilalang antibody na diagnostic serum):
serological identification (pagkilala sa species);
serotyping (pagpapasiya ng serovar) - pagpapasiya ng strain;
sa pathological na materyal (mabilis na diagnostic);
sa purong kultura:
b) upang makita ang mga antibodies (Ig) (antigen ay kilala-diagnosticum):
presensya (mga reaksyon ng husay);
dami (pagtaas ng titer - paraan ng "pinares na serum").
4) Pangkalahatang pag-uuri serological reaksyon :
a) simple (2-component: Ag+Ig):
Mga reaksyon ng agglutination ng RA (na may corpuscular antigen);
PR precipitation reactions (na may natutunaw na antigen);
b) kumplikado (3-sangkap: Ag+Ig+C);
c) gamit ang isang tag.
Mga variant ng agglutination at precipitation reactions
Reaksyon ng aglutinasyon :
Agglutination reaction (RA) ay isang immune reaction ng interaksyon ng isang suspensyon ng antigens (erythrocytes, bacteria) na may antigens sa physiological solution.
Sa panahon ng agglutination, ang mga particle ng AT ay magkakadikit upang bumuo ng flocculent sediment.
Ang passive hemagglutination reaction (RPHA) ay isang uri ng agglutination reaction kung saan ginagamit ang isang antibody o antigen erythrocyte diagnosticum (erythrocytes na may AT o AG na adsorbed sa ibabaw ng mga ito).
Ang mga pulang selula ng dugo ay kumikilos bilang mga passive carrier sa reaksyong ito.
Ang pagsusuri ng mga resulta ng RPGA ay isinasagawa tulad ng sumusunod:
- sa positibong reaksyon tinatakpan ng passively adhered red blood cell ang ilalim ng U- o V-shaped na butas sa pantay na layer na may scalloped edges (“umbrella”);
- sa negatibong reaksyon (sa kawalan ng agglutination), ang mga pulang selula ng dugo ay naipon sa gitnang recess ng butas, na bumubuo ng isang compact na "button" na may malinaw na tinukoy na mga gilid.
Ang hemagglutination inhibition test (HAI) ay ginagamit sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral. Ang ilang mga virus ay naglalaman ng isang protina na tinatawag na hemagglutinin sa kanilang ibabaw, na pinagdikit ang mga pulang selula ng dugo. Ang pagdaragdag ng mga tiyak na antiviral antibodies ay humaharang sa viral hemagglutinin - walang hemagglutination.
Ang indirect hemagglutination reaction (IRHA), o Coombs reaction, ay ginagamit upang matukoy ang mga hindi kumpletong antibodies. Ang pagdaragdag ng antiglobulin serum (AT laban sa Ig ng tao) ay nagpapahusay sa mga resulta ng reaksyon. Ginagamit ang RNGA upang matukoy ang Rh factor.
Upang magsagawa ng agglutination reaction (RA), tatlong sangkap ang kinakailangan:
1) antigen (agglutinogen) AG;
2) antibody(agglutinin) AT;
3)
electrolyte
(isotonic sodium chloride solution).
Ag + AT + electrolyte = aglutinate
Agglutination (mula sa Latin agglutinatio - gluing) - gluing ng corpuscles (bakterya, pulang selula ng dugo, atbp.) Na may mga antibodies sa pagkakaroon ng electrolytes - sodium chloride.
Ang RA ay nagpapakita ng sarili sa anyo ng mga natuklap o sediment na binubuo ng mga corpuscles (halimbawa, bakterya, mga pulang selula ng dugo) na "nakadikit" ng mga antibodies.
Ginagamit ang RA para sa:
Direktang reaksyon ng microbial agglutination (RA).
Sa reaksyong ito, direktang pinagsasama-sama ng mga antibodies (agglutinin) ang mga corpuscular antigens (agglutinogens).
Ang mga ito ay karaniwang kinakatawan ng isang suspensyon ng mga hindi aktibo na microorganism (microbial agglutination reaction).
Upang matukoy ang uri ng mga microorganism, gamitinkaraniwang diagnostic agglutinating suwero ( sikat na AT ).
Ang pinakakaraniwan ay lamellar (tinatayang) at pinalawak na RA.
Ang plate RA ay inilagay sa salamin. Ito ay ginagamit bilang isang pinabilis na paraan para sa pag-detect ng mga antibodies o pagkilala sa mga microorganism.
Mga Bahagi:
1. karaniwang diagnostic agglutinating sera (AT);
2. purong kulturang pinag-aaralan mula sa pasyente;
3. solusyon sa asin.
Sa purong kulturang pinag-aaralan, ang mga antigen (AG) ay nasa anyo ng mga particle (microbial cells, erythrocytes at iba pang corpuscular antigens), na pinagdikit ng mga antibodies at namuo.
Halimbawa:
pagtatanghal ng dula nagpapakilala mga reaksyon ng aglutinasyon (RA ) sa salamin para sa layunin ng pagkilala sa coliform bacteria.
Ilapat ang mga patak sa isang glass slide:
1
dysentery
;
2
-th drop: - agglutinating serum laban sa pathogenstyphoid fever
;
(1-2 diagnostic sera)
3
-th drop: - saline solution (kontrol).
Idagdag ang nasubok na purong bacterial culture sa bawat drop. Haluin.
Resulta
:
positibo
- pagkakaroon ng agglutinate flakes,
negatibo
- kawalan ng agglutinate flakes
Konklusyon:Ang mga pinag-aralan na bakterya ay mga sanhi ng ahente ng typhoid fever (natukoy ang mga antigen).
Upang matukoy ang AT sa serum ng pasyente (serological diagnosis), isang karaniwang microbialdiagnosticum , na naglalaman ng suspensyonsikat microbes o ang kanilang mga antigensAG .
Pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo ng ABO (hemagglutination reaction (HRA)) – pinagsasama-sama ang mga pulang selula ng dugo.
Mga bahagi ng reaksyon:
1. Pagsusuri ng dugo ng AG (red blood cells).
2. AT (erythrotests - zoliclones)
Set ng zoliclons:
Coliclone anti-A reagent (pink)
Coliclone anti-B reagent (asul)
Reagent Tsoliklon anti-AV (walang kulay)
3. electrolyte (solusyon sa asin)
Teknik ng pagpapasiya:
1
.
Ang isang patak (0.1 ml) ng anti-A, anti-B at anti-AB zolicone ay inilalapat sa mga balon ng tablet (para sa kontrol).
2.
Sa tabi ng bawat patak ng reagent, ang isang maliit na (0.05-0.01 ml) na patak ng dugong sinusuri ay inilapat.
Pagkatapos ang isang patak ng zoliclone ay halo-halong may isang patak ng dugo gamit ang isang indibidwal na malinis na glass rod.
3.
Ang reaksyon ng agglutination ay bubuo sa unang 3-5 segundo na may banayad na pag-alog ng plato.
Ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang 2.5 - 3 minuto pagkatapos ng paghahalo ng mga patak. Mula kaliwa hanggang kanan sa mga balon ay anti-A, anti-B, anti-AB.
Ang isang positibong resulta ay ang hitsura ng isang butil-butil na sediment (agglutinate).
positibong RA (+)
Negatibo - walang sediment.
negatibong RA(-)
4.
Pagsusuri ng mga resulta.
O(ako) α β – walang agglutination
A(II) β – agglutination na may anti-A
B(III) α – agglutination na may anti-B
AB(IV)O – agglutination na may anti-A, na may anti-B
Schematic na representasyon ng agglutination.
Ag antigens sa erythrocytes (detectable) + antibodyAT(zoliclon) diagnostic serum
Accounting para sa agglutination sa mga tablet
Reaksyon sa pag-ulan:
Ang reaksyon ng precipitation ay isang immune reaction ng interaksyon ng antigen sa isang natutunaw na estado na may antigen sa isang physiological solution.
Sa panahon ng pag-ulan, nabuo ang isang macromolecular immune complex, na ipinakita sa pamamagitan ng paglipat ng isang transparent na colloidal solution sa isang opaque na suspensyon, o precipitate.
Ang halaga ng parehong mga reagents ay dapat na nasa mahigpit na tinukoy na mga sukat, dahil ang labis sa isa sa mga ito ay binabawasan ang resulta.
Mayroong iba't ibang mga paraan upang maisagawa ang reaksyon ng pag-ulan.
1. Ang reaksyon ng pag-ulan ng singsing ay isinasagawa sa mga tubo ng pag-ulan na may maliit na diameter. Ang immune serum ay idinagdag sa test tube at ang natutunaw na antigen ay maingat na pinagpatong. Pinaghalong AG at AT dahil sa thermal na paggalaw ng mga molekula, at nakikipag-ugnayan sila. Kung positibo ang resulta, ang isang singsing ng opaque na namuo ay bumubuo sa interface ng dalawang solusyon.
2. Ang Ouchterlony double immunodiffusion reaksyon ay isinasagawa sa isang agar gel, sa mga balon kung saan ang alinman sa isang solusyon sa AG o isang solusyon sa AT ay idinagdag ayon sa pamamaraan. Ang AG at AT ay nagkakalat sa gel patungo sa isa't isa at, kung ang reaksyon ay positibo, bumubuo ng mga immune complex na nakikita bilang mga linya ng pag-ulan.
Reaksyon sa pag-ulan -ito ay pagbuoat pag-ulan ng natutunaw na molekular na antigen-antibody complex bilang isang ulap na tinatawag na precipitate. Ito ay nabuo sa pamamagitan ng paghahalo ng mga antigen at antibodies sa katumbas na dami.
Mga bahagi ng RA:
precipitating serum (kilalang AT-precipitin);
test serum (hindi kilalang precipitinogen antigen);
pisikal Solusyon.
Ang reaksyon ng pag-ulan ay isinasagawa alinman sa mga espesyal na makitid na tubo ng pagsubok (ring precipitation reaction), o sa mga Petri dish sa mga gel, nutrient media, atbp.
Reaksyon ng ring-pricipitation
Pahayag at pagtatala ng mga resulta ng reaksyonringprecipitationupang makita ang causative agent ng anthrax (reaksyon ng Ascoli).
pagtatanghal ng dula .
1. Ang materyal na pinag-aaralan (katad, lana, nadama, balahibo, tela, karne, lupa, dumi ng hayop, atbp.) ay pinakuluan sa solusyon ng asin sa loob ng 5-45 minuto. upang makakuha ng isotonic extract (extract). Na-filter.
2. Ang namuong anti-anthrax serum ay ibinubuhos sa isang test tube.
3. Maingat na i-layer ang test material (extract) dito.
Accounting .
Sa loob ng susunod na 10 minuto. Sa mga positibong kaso, lumilitaw ang isang ring ng labo sa interface sa pagitan ng serum at extract (ring precipitation). Ang reaksyon ng Ascoli ay napakasensitibo at tiyak
Sa tulong nito, posible na mabilis na makilala ang mga materyales na nahawaan ng anthrax.
Reaksyon ng pag-ulan sa agar
Pahayag at pagtatala ng mga resultamga reaksyon ng pag-ulan sa agarupang matukoy ang toxigenicity ng corynebacteria (causative agents ng diphtheria)
pagtatanghal ng dula
Inilagay sa phosphate peptone agar sa isang Petri dish.
1. Maglagay ng strip ng sterile filter paper na binasa sa gitna ng tasa.antitoxic serum.
2. Pagkatapos ng pagpapatayo, sa layo na 1 cm mula sa gilid ng strip, ang mga plake na may diameter na 10 mm ay ibinuhos.mga piling pananim.
Sa isang tasa maaari kang maghasik ng 3 hanggang 10 pananim, isa sa mga itokontrol, dapat malamannakakalason.
Ang mga pananim ay inilalagay sa isang termostat.
Accounting
Ang pagsusuri ay isinasagawa pagkatapos ng 24-48-72 na oras.
Positibong resulta - (kulturatoxigenic) - sa ilang distansya mula sa strip ng papel ay lilitawnamuo na mga linya, « tendril arrow", na malinaw na nakikita sa ipinadalang liwanag.
Ang figure ay nagpapakita ng precipitation reaction sa agar upang matukoy ang toxigenicity ng diphtheria bacilli. Ang mga katamtamang kultura ay hindi nakabuo ng "mga arrow-tendril" ang mga ito ay hindi toxicogenic pathogens.
Ang mga strain ng causative agent ng diphtheria ay maaaring toxigenic (paggawa ng exotoxin) at nontoxigenic. Ang pagbuo ng isang exotoxin ay nakasalalay sa pagkakaroon ng bakterya ng isang prophage na nagdadala ng isang tox gene na naka-encode sa pagbuo ng isang exotoxin.
Sa kaso ng sakit, ang lahat ng diphtheria pathogens ay sinusuri para sa toxigenicity - paggawa ng diphtheria exotoxin gamit ang precipitation reaction sa agar
Mga kumplikadong serological reaksyon ( 3-sangkap: Ag+Ig+C):
Complement fixation reaction (CFR).
Ang reaksyon ay isinasagawa sa dalawang yugto.
Sa unang yugto, ang AT ay nakikipag-ugnayan sa AG at umakma sa pangalawang yugto, isang tagapagpahiwatig ay idinagdag - ang hemolytic system (isang pinaghalong erythrocytes at anti-erythrocyte serum).
Kung positibo ang resulta, sa unang yugto, ang mga antibodies ay bumubuo ng isang immune complex na may mga antigen, na nagbubuklod sa pandagdag ng pinaghalong reaksyon.
Sa kasong ito, ang mga pulang selula ng dugo ng hemolytic system na idinagdag sa ikalawang yugto ay hindi nawasak.
Kung hindi, ang unbound complement ay nagiging sanhi ng lysis ng indicator red blood cells.
Upang maisakatuparan ito, limang sangkap ang kailangan: AG, AT at complement (unang sistema), mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum (pangalawang sistema) (Fig. 1).
Ang reaksyon ay nangyayari sa dalawang yugto (Larawan 3).
Unang yugto - pakikipag-ugnayan ng antigen at antibodies na may sapilitan na pakikilahok ng pandagdag.
Pangalawa - pagkilala sa mga resulta ng reaksyon gamit ang isang indicator hemolytic system (mga pulang selula ng dugo ng tupa at hemolytic serum). Ang pagkasira ng mga pulang selula ng dugo sa pamamagitan ng hemolytic serum ay nangyayari lamang kung ang pandagdag ay idinagdag sa hemolytic system. Kung ang pandagdag ay dating na-adsorbed sa antigen-antibody complex, kung gayon ang hemolysis ng mga erythrocytes ay hindi mangyayari (Fig.).
Resulta ng karanasan
tinasa (Larawan 2), pagpuna sa pagkakaroon o kawalan ng hemolysis sa lahat ng mga tubo. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kapag ang hemolysis ay ganap na naantala, kapag ang likido sa test tube ay walang kulay at ang mga pulang selula ng dugo ay tumira sa ilalim, negatibo - kapag ang mga pulang selula ng dugo ay ganap na na-lysed, kapag ang likido ay matinding kulay ("barnis" na dugo ).
Ang antas ng pagkaantala ng hemolysis ay tinasa depende sa intensity ng kulay ng likido at ang laki ng red blood cell sediment sa ibaba (++++, +++, ++, +).
kanin. 4. Pahayag at resulta ng RSC.
Konklusyon:Ang mga antibodies ay nakita sa test serum.
Binibigyang-daan ka ng RSK na makakita ng mga antibodies sa anumang strain ng parehong serotype ng virus.
Ang halaga ng diagnostic ay mayroong:
apat na beses na pagtaas ng antibody titer sa ipinares na sera (sa panahon ng epidemya ng trangkaso);
isang dalawang beses na pagtaas sa serum ng dugo ng mga pasyente na may isang katangian na klinikal na larawan.
Mga reaksyon gamit ang isang tag :
Ang mga pamamaraang ito ay lubhang sensitibo. Ang mga tina, radioactive isotopes, enzyme, atbp. ay ginagamit bilang mga label para sa mga antigen o antibodies.
RIF - reaksyon ng immunofluorescence
Ang reaksyon ng immunofluorescence ay batay sa liwanag na indikasyon ng antigen-antibody complex
Enzyme immunoassay.
Isang modernong pagsubok sa laboratoryo na naghahanap ng mga tiyak na antibodies sa dugo o mga antigen sa mga partikular na sakit upang matukoy hindi lamang ang etiology, kundi pati na rin ang yugto ng sakit.
Ang mga resulta ng ELISA ay maaaring ibigay sa qualitatively at quantitatively.
Sa kasalukuyan, ang ELISA ay ginagamit sa mga sumusunod na sitwasyon:
1) maghanap ng mga tiyak na antibodies sa anumang nakakahawang sakit;
2) maghanap ng mga antigen ng anumang sakit (nakakahawa, venereological);
3) pag-aaral ng hormonal status ng pasyente;
4) pagsusuri para sa mga marker ng tumor;
5) pagsusuri para sa pagkakaroon ng mga sakit na autoimmune.
Sa figure, solid-phase ELISA - kilalang antigens (sa kaliwa) adsorbed sa balon ng plate, (sa kanan) sa mga balon ng plate na kilala antigens
Mga kalamangan ng pamamaraang ELISA:
1) Mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo ng pamamaraang ELISA (higit sa 90%).
2) Ang kakayahang matukoy ang sakit at subaybayan ang dynamics ng proseso, iyon ay, paghahambing ng dami ng antibodies sa iba't ibang yugto ng panahon.
3) Availability ng ELISA diagnostics sa anumang institusyong medikal.
Kamag-anak na kawalan: Ang pagtuklas ng isang immune response (antibodies), ngunit hindi ang pathogen mismo, na pinagsama sa isang tag enzyme.
ELISA test (pangkalahatang mekanismo):
Ang batayan ng enzyme immunoassay ay ang immune reaksyon ng antigen at antibody na may pagbuo ng isang immune complex: antigen-antibody, na nagreresulta sa pagbabago sa aktibidad ng enzymatic ng mga tiyak na marka sa ibabaw ng mga antibodies.
Mga bahagi ng reaksyon:
1. Kilala ang AG(AT) - sa balon ng tableta.
2. AT (AG) na pinag-aaralan.
3. AT na may enzyme, partikular sa AT(AG)-AG(AT) complex
4. chromogenic substrate na nakikipag-ugnayan sa enzyme
5. itigil ang solusyon
Pangunahing yugto ng ELISA
1. Sa ibabaw ng mga balon ng plato mayroong isang purified antigen ng isang tiyak na pathogen. Ang biological na materyal ng pasyente ay idinagdag sa kanila, at isang tiyak na reaksyon ang nangyayari sa pagitan ng antigen na ito at ng nais na antibody (immunoglobulin). Isang complex ang nabuo.
2. Ang isang conjugant ay idinagdag - AT kasama ang enzyme. Ang conjugant ay tiyak sa AT-AG complex ng unang yugto. Ang enzyme ay isinaaktibo.
3. Ang substrate ay idinagdag at ang aktibong enzyme ay tumutugon dito, binabago ang walang kulay na kulay ng solusyon.
4. Ang isang stop solution ay idinagdag upang ihinto ang pakikipag-ugnayan ng enzyme-substrate.
Accounting.
Ang isang positibong resulta ay isang pagbabago sa kulay, dilaw sa larawan.
Pagsusuri ng immunochromatographic
Ang immunochromatographic analysis method (ICA, rapid tests) ay isang mataas na kalidad na paunang paraan ng screening na nagbibigay-daan sa iyo upang mabilis, sa loob ng ilang minuto, magsagawa ng pagsusuri sa ilalim ng anumang mga kundisyon, kasama. "patlang".
Ang mga pakinabang ng ICA ay kinabibilangan ng:
Bilis at kadalian ng paggamit;
Maliit na dami ng sample, kakulangan ng paghahanda ng sample;
Mura para sa tagagawa at mamimili;
Posibilidad ng paggawa ng mga pagsubok sa malalaking volume;
Dali ng pagbabasa at interpretasyon ng resulta;
Mataas na sensitivity at reproducibility;
Posibilidad ng quantitative determination;
Posibilidad ng paggamit ng mga portable reader na katugma sa isang computer;
Posibilidad ng multi-analysis.
Mga bahagi (inilapat sa test strip):
1. Ang conjugate na may label na colloidal gold ay partikular sa nakitang antigen.
2. AT test line – partikular sa AT-AG complex
3. Ang mga abs ng control line ay tiyak sa conjugate.
Setting ng ICA:
1. Ilapat ang sample sa itinalagang panimulang lugar ng strip.
2. Pagkuha ng resulta sa anyo ng paglitaw ng mga kulay na guhit sa lugar ng mga linya ng pagsubok at kontrol.
Accounting
Positibo - kapag ang linya ng pagsubok ay nabahiran.
Negatibo - kung walang paglamlam ng linya ng pagsubok.
Di-wasto – kung ang linya ng kontrol ay hindi nabahiran.
Pangkalahatang mekanismo ng ICA:
1. Ang sample ay ipinakilala sa panimulang field (sample pad) at nauugnay sa conjugate (isang partikular na katawan na may kulay na label), na matatagpuan sa conjugate pad. Bilang isang resulta, ang isang kulay na kumplikado ay nabuo.
2. Ang nagreresultang kulay na immune complex ay gumagalaw sa ilalim ng pagkilos ng mga puwersa ng capillary kasama ang nitrocellulose membrane At nakikipag-ugnayanmay AT test line.Ang resulta ay isang solong kulay rosas-pulang guhit.
3. AT (conjugate) na hindi nakatali sa nasubok na bandagumagalaw pa at umabot sa control line, nakikipag-ugnayan sa AT ng control line.Bilang resulta, lumilitaw ang pangalawang kulay na guhit.Kung ang pagsusuri ay isinasagawa nang tama, ang Control line ay dapat palaging lumitaw, anuman ang pagkakaroon ng pagsubok na antigen (antibody) sa biological fluid sample.
2. Mga kondisyon para sa pagsasagawa ng serological reactions.
1. Ang pagkakaroon ng homologous - naaayon sa bawat isa antigen at antibody.
2. Malinis at tuyong mga pinggan.
3. Isang tiyak na ratio ng mga gamot (madalas na katumbas).
4. Mandatory na presensya ng isang electrolyte (isotonic NaCl solution).
5. pH neutral o malapit sa bahagyang alkalina.
6. Temperatura +37°C o temperatura ng silid (kinakailangang positibo).
7. Ang antigen control at serum (antibody) control ay isinasagawa.
3 Mga kinakailangan sa suwero
Ang suwero ay dapat na ganap na transparent nang walang anumang admixture ng mga cell.
Karaniwang natatanggap nila ito sa ika-2 linggo ng sakit, kapag magagamit na ang mga antibodies.
Ang dugo ay kinuha sa dami ng 3-5 ml sa walang laman na tiyan o 6 na oras pagkatapos kumain.
Upang makakuha ng suwero, ang dugo ay naiwan sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid o naka-centrifuge. Ang suwero ay sinipsip nang maingat upang hindi makuha ang mga nabuong elemento.
Ang mga immune serum ay nakuha mula sa dugo ng mga tao o hayop (karaniwan ay mga kuneho at kabayo), na nabakunahan ayon sa isang tiyak na pamamaraan na may kaukulang antigen (bakuna). Ang mga serum ay kadalasang inihahanda sa paggawa.
4. Ang konsepto ng positibo at negatibong resulta.
RA.
Sa positibong reaksyon, tinatakpan ng passively glued red blood cell ang ilalim ng butas sa pantay na layer na may mga scalloped na gilid (“payong”); sa kawalan ng agglutination, ang mga pulang selula ng dugo ay naipon sa gitnang recess ng butas, na bumubuo ng isang compact na "button" na may malinaw na tinukoy na mga gilid (tingnan ang mga larawan sa itaas).
RP.
Kung positibo ang resulta, mabubuo ang parang gatas na singsing sa interface ng dalawang solusyon (tingnan ang mga larawan sa itaas).
ELISA.
Ang pagbabago sa kulay ng solusyon ay nangyayari sa isang positibong reaksyon.
RSK.
Naantala ang hemolysis - positibo ang reaksyon; kung ang complement ay libre, ang hemolysis ay sinusunod - ang reaksyon ay negatibo(tingnan ang mga larawan sa itaas).
Mga resulta ng reaksyon ng Wasserman:
a - kumpletong pagkaantala ng hemolysis (+ + ++);
b - binibigkas na pagkaantala sa hemolysis (+ ++);
c - bahagyang pagkaantala ng hemolysis (++);
d - bahagyang pagkaantala sa hemolysis (+);
d - kumpletong hemolysis (-).
Ang reaksyon ay positibo na may bahagyang, binibigkas at kumpletong pagkaantala ng hemolysis, na tinutukoy ng antas ng paglamlam ng mga nilalaman ng mga tubo mula sa light pink hanggang sa maliwanag na pula na hindi hemolyzed na erythrocytes na kasunod ay bumubuo ng isang pulang namuo.
Takdang-Aralin:
1. Pag-aralan ang materyal
Gumawa ng 3 tala sa video
No. 29 Agglutination reaksyon. Mga bahagi, mekanismo, paraan ng pag-install. Aplikasyon.
Reaksyon ng aglutinasyon- isang simpleng reaksyon kung saan ang mga antibodies ay nagbubuklod sa mga corpuscular antigens (bacteria, erythrocytes o iba pang mga cell, hindi malulutas na mga particle na may mga antigens na na-adsorbed sa kanila, pati na rin ang mga macromolecular aggregates). Ito ay nangyayari sa pagkakaroon ng mga electrolyte, halimbawa, kapag ang isotonic sodium chloride solution ay idinagdag.
Ang iba't ibang mga variant ng reaksyon ng agglutination ay ginagamit: malawak, indicative, hindi direkta, atbp Ang reaksyon ng agglutination ay ipinakita sa pamamagitan ng pagbuo ng mga natuklap o sediment (mga cell na "nakadikit" na may mga antibodies na may dalawa o higit pang mga antigen-binding center - Fig. 13.1). Ginagamit ang RA para sa:
1) mga pagpapasiya ng antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente, halimbawa, na may brucellosis (Wright, Heddelson reaction), typhoid fever at paratyphoid fever (Vidal reaction) at iba pang mga nakakahawang sakit;
2) pagtukoy ng pathogen, nakahiwalay sa isang pasyente;
3) pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo gamit ang monoclonal antibodies laban sa erythrocyte alloantigens.
Upang matukoy ang mga antibodies sa isang pasyente magsagawa ng isang detalyadong reaksyon ng agglutination: Ang Diagnosticum (isang suspensyon ng mga pinatay na mikrobyo) ay idinagdag sa mga dilution ng serum ng dugo ng pasyente, at pagkatapos ng ilang oras ng pagpapapisa ng itlog sa 37 °C, ang pinakamataas na serum dilution (serum titer) ay nabanggit, kung saan naganap ang agglutination, ibig sabihin, isang precipitate ay nabuo.
Ang kalikasan at bilis ng agglutination ay nakasalalay sa uri ng antigen at antibodies. Ang isang halimbawa ay ang mga kakaiba ng pakikipag-ugnayan ng diagnosticums (O- at H-antigens) na may mga tiyak na antibodies. Ang agglutination reaction na may O-diagnosticum (bacteria na pinatay ng init, pinapanatili ang thermostable O-antigen) ay nangyayari sa anyo ng fine-grained agglutination. Ang agglutination reaction na may H-diagnosticum (bacteria na pinatay ng formaldehyde, na pinapanatili ang thermolabile flagellar H-antigen) ay magaspang at mas mabilis na nagpapatuloy. Kung kinakailangan upang matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa pasyente, ilagay nagpapahiwatig na reaksyon ng agglutination, gamit ang diagnostic antibodies (agglutinating serum), i.e., ang serotyping ng pathogen ay isinasagawa. Ang isang indikatibong reaksyon ay isinasagawa sa isang glass slide. Ang isang purong kultura ng pathogen na nakahiwalay mula sa pasyente ay idinagdag sa isang patak ng diagnostic agglutinating serum sa isang pagbabanto ng 1:10 o 1:20. Ang isang kontrol ay inilalagay sa malapit: sa halip na serum, isang patak ng sodium chloride solution ang inilapat. Kapag lumilitaw ang isang flocculent sediment sa isang drop na may serum at microbes, ang isang detalyadong reaksyon ng agglutination ay ginaganap sa mga test tube na may pagtaas ng mga dilution ng agglutinating serum, kung saan idinagdag ang 2-3 patak ng isang suspensyon ng pathogen. Ang aglutinasyon ay isinasaalang-alang ng dami ng sediment at ang antas ng linaw ng likido. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kung ang agglutination ay sinusunod sa isang pagbabanto na malapit sa titer ng diagnostic serum. Kasabay nito, ang mga kontrol ay isinasaalang-alang: ang serum na diluted na may isotonic sodium chloride solution ay dapat na transparent, ang suspensyon ng microbes sa parehong solusyon ay dapat na pantay na maulap, nang walang sediment.
Ang iba't ibang kaugnay na bakterya ay maaaring pagsama-samahin ng parehong diagnostic agglutinating serum, na
ginagawang mahirap ang kanilang pagkakakilanlan. Samakatuwid, gumagamit sila ng adsorbed agglutinating sera, kung saan inalis nila
cross-reacting antibodies sa pamamagitan ng adsorption sa mga kaugnay na bakterya. Ang mga antibodies ay napanatili sa naturang sera,
tiyak lamang sa isang partikular na bacterium.
Detalyadong reaksyon ng agglutination (RA). Upang matukoy ang AT sa serum ng dugo ng pasyente, a malawak na agglutination reaction (RA). Upang gawin ito, ang isang diagnosticum ay idinagdag sa isang serye ng mga dilutions ng serum ng dugo - isang suspensyon ng mga pinatay na microorganism o mga particle na may sorbed Ag. Ang maximum na pagbibigay ng pagbabanto aglutinasyon Ag ay tinatawag na serum titer.
Mga uri ng reaksyon ng aglutinasyon (RA) upang matukoy ang AT - isang blood-drop test para sa tularemia (na may diagnosticum na inilapat sa isang patak ng dugo at ang hitsura ng mga nakikitang mapuputing agglutinate) at ang Huddleson test para sa brucellosis (na may diagnosticum na nabahiran ng gentian violet na inilapat sa isang patak ng dugo suwero).
Tinatayang agglutination reaction (RA)
Upang matukoy ang mga nakahiwalay na microorganism, isang tinatayang RA ang inilalagay sa mga glass slide. Upang gawin ito, ang isang pathogen culture ay idinagdag sa isang patak ng karaniwang diagnostic antiserum (diluted 1:10, 1:20). Kung ang resulta ay positibo, ang isang detalyadong reaksyon ay isinasagawa sa pagtaas ng mga dilution ng antiserum.
Reaksyon itinuturing na positibo kung ang agglutination ay sinusunod sa mga pagbabanto na malapit sa titer ng diagnostic serum.
OAS. Somatic O-Ags ay heat stable at kayang kumulo sa loob ng 2 oras Kapag nakikipag-ugnayan sa AT, bumubuo sila ng mga pinong butil.
N-Ag. N-Ag (flagellates) ay thermolabile at mabilis na bumababa sa 100 °C, pati na rin sa ilalim ng impluwensya ng ethanol. Sa mga reaksyon sa H-antiserum, pagkatapos ng 2 oras ng pagpapapisa ng itlog, ang mga maluwag na malalaking natuklap ay nabuo (nabubuo ng bakterya na dumidikit sa flagella).
Vi-Ar Ang bakterya ng typhoid ay medyo hindi matatag sa init (nakatiis sa temperatura na 60-62 °C sa loob ng 2 oras); Kapag incubated na may Vi antiserum, isang fine-grained agglutinate ay nabuo.
Direktang reaksyon ng hematglutination
Ang pinakasimple sa mga ito mga reaksyon - aglutinasyon pulang selula ng dugo, o hemagglutination, na ginagamit upang matukoy ang mga pangkat ng dugo sa ABO system. Upang matukoy aglutinasyon(o kakulangan nito) gumamit ng karaniwang antisera na may mga anti-A at anti-B na agglutinin. Ang reaksyon ay tinatawag na direkta, dahil ang Ags na pinag-aaralan ay mga natural na bahagi ng mga pulang selula ng dugo.
Karaniwan sa direktang hematglutination Ang viral hemagglutination ay may mga mekanismo. Maraming mga virus ang may kakayahang kusang pagsama-samahin ang mga erythrocyte ng mga ibon at mammal ang kanilang pagdaragdag sa isang suspensyon ng mga erythrocytes ay nagiging sanhi ng pagbuo ng mga aggregate mula sa kanila.
Reaksyon ng aglutinasyon Reaksyon ng aglutinasyon
(RA) ay isang paraan para sa pagtukoy at pagbibilang ng Ag at Ab, batay sa kanilang kakayahang bumuo ng mga agglomerates na nakikita ng mata. Sa departamento ng mga nakakahawang sakit. ang mga sakit o para sa iba pang mga layunin ay ginagamit upang makilala ang mga hindi kilalang mikrobyo at mga selula, upang matukoy ang presensya at dami ng mga antibodies sa dugo at iba pang mga likido. Ang prinsipyo ng pagpapasiya ay batay sa pagtitiyak ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng Ag at Ab at binubuo sa paghahanap ng kilala mula sa hindi alam. Mayroong maraming mga opsyon para sa RA: quantitative at qualitative, test tube at glass, volumetric at droplet, conventional, accelerated at express na mga pamamaraan. Upang i-stage RA kailangan mo: 1) s-ka dugo. Sa variant sa pagtukoy ng uri (var) ng bakterya, ginagamit ang mga pang-industriyang agglutinating na pagsusulit, na ginawa ng mga kuneho na nagpapabakuna. Sa variant na may pagpapasiya ng uri ng Ab, isang sample ng dugo ang kinuha mula sa pagsubok. tao o hayop. Ang solusyon ay dapat na sterile at walang nasuspinde na mga particle. Ihanda ang pangunahing pagbabanto sa solusyon ng asin. Dapat itong 2-4 beses na mas mababa kaysa sa diagnostic titer para sa sakit na ito; 2) Ag. Sa bersyon ng reaksyon na may pagpapasiya ng uri ng Ab, ginagamit ang mga pang-industriyang diagnostic kit; sa variant na may pagpapasiya ng Ag, ang mga diagnosticum ay inihanda sa kanilang sarili sa anyo ng isang 1-3 bilyong suspensyon sa isang solusyon sa asin ng 18-20-oras na agar (mas madalas na sabaw) na pagsubok. microbe inactivated sa pamamagitan ng pag-init sa isang paliguan ng tubig sa 70°C para sa 1 oras o sa pamamagitan ng 24-oras na incubation sa 37°C na may formaldehyde (panghuling konsentrasyon 0.2%); 3) electrolyte sa anyo ng saline solution. Teknik ng pagtatanghal volumetric serial tube RA upang matukoy ang Ab titer sa s-ki: ilang hanay ng mga gumaganang dilution ang inihanda mula sa pangunahing pagbabanto ng s-ki. Ang bilang ng mga hilera ay depende sa bilang ng mga diagnosticum na kinuha sa eksperimento; ang bilang at mga kadahilanan ng pagbabanto ay tinutukoy ng diagnostic titer ng pinaghihinalaang sakit. Ang serye ay dapat man lang maglaman ng dilution na tumutugma sa diagnostic Ab titer, dalawang dilution sa ibaba at dalawang dilution sa itaas nito. Pagkatapos nito, natutukoy ang titer: ang pinakamataas na pagbabanto na may intensity ng agglutination na hindi bababa sa 2 plus. Pananaliksik sa pamagat Ang s-ki ay inihambing sa diagnostic titer para sa sakit na ito. Kung susuriin ang titer. Ang s-ki ay 2 beses na mas mababa kaysa sa diagnostic na halaga, ang reaksyon ay tinasa bilang nagdududa; kung ang titer ay katumbas ng diagnostic isa - bilang mahina positibo; kung ito ay 2-4 na beses na mas mataas, ito ay itinuturing na positibo kung ito ay 8 o higit pang beses na mas mataas, ito ay itinuturing na positibo. Kapag ang Ab ay laganap sa malulusog na tao, ang pagtaas ng Ab titer ay ginagamit upang masuri ang RA. Upang matukoy ang uri ng Ag sa serial RA, ang bilang ng mga row ay dapat tumugma sa bilang ng mga diagnostic sample na kinuha para sa pagkakakilanlan. Mula sa pangunahing dilution ng diagnostic test, isang serye ng sunud-sunod na dalawang-tiklop na dilution ay inihanda sa parehong paraan tulad ng sa RA upang matukoy ang Ab titer. Ang mga kadahilanan ng pagbabanto ay nakasalalay sa titer ng agglutinating test Sa eksperimento, ang pagkakaroon ng isang pagbabanto na katumbas ng titer ng pagsubok ay kinakailangan, pati na rin ang 2, 4, 6, 8 beses na mas mababa kaysa dito titer ng diagnostic test ay 1 3200, pagkatapos ay dapat mong gamitin ang mga dilution 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Ang parehong dami ng nasubok na Ag ay idinagdag sa mga dilution ng pagsubok, bilang isang resulta, ang pagbabanto ng ang pagsubok ay tumaas ng 2 beses na kontrol at Ag ay idinagdag sa eksperimento Kung sa eksperimento ay ilang s-k ang kasangkot, kung gayon ang bawat isa sa kanila ay nangangailangan ng sarili nitong kontrol Sa pagtatapos ng reaksyon, ang stand ay inalog nang malakas at inilagay sa isang termostat sa 37 ° C. Ang mga resulta ay isinasaalang-alang tulad ng inilarawan sa itaas Ang pagsusuri ng reaksyon ay may mga tampok. Ag kinuha sa eksperimento, ang titer ng reaksyon ay dapat na tumutugma sa hindi bababa sa kalahati ng titer ng karaniwang diagnostic na pagsusulit ay itinuturing na isang reaksyon ng grupo Tumulo ang md Ang staging ng RA ay naiiba sa volumetric dahil ang s-ku ay natunaw sa dami ng 1 ml, Ag ay ginagamit sa isang mas mataas na konsentrasyon (10 bilyon/ml) at ito ay idinagdag 1 - 2 bumaba sa isang test tube Ang pagbabanto ng gamot pagkatapos idagdag ang Ag ay itinuturing na hindi nagbabago, kung hindi, ang paraan ng pagtatakda, pagtatala at pagsusuri ay katulad ng volumetric na paraan
(Pinagmulan: Dictionary of Microbiology Terms)
