Pagsusuri sa antiglobulin. Direkta at hindi direktang reaksyon ng Coombs

Direktang pagsubok ng Coombs. Ang pagsusulit na ito ay ginagamit upang patunayan ang pagkakaroon ng pagharang ng mga antibodies na naayos sa mga pulang selula ng dugo ng bata. Ang isang positibong direktang pagsusuri ay nagpapahiwatig ng sensitization at nagsisilbing isang nakakumbinsi na tanda ng hemolytic disease ng bagong panganak kahit na bago ang paglitaw ng iba pang mga klinikal na palatandaan. Bilang eksepsiyon at sa mga napakalubhang kaso lamang, maaaring negatibo ang direktang pagsusuri sa Coombs dahil sa nagaganap na, halos kumpletong hemolysis ng mga sensitized na pulang selula ng dugo.

Ang isang direktang pagsusuri sa Coombs ay isinasagawa tulad ng sumusunod: 5 patak ng dugo na kinuha mula sa takong ng bata ay inilagay sa isang test tube at 5 ml ng asin ay idinagdag. Haluing mabuti at i-centrifuge sa loob ng 10 minuto. Ang malinaw na likido sa itaas ng red blood cell sediment ay pinaghihiwalay. Pagkatapos ay magdagdag muli ng 5 ML ng asin, ihalo at centrifuge. Pagkatapos ng paghahalo sa asin ng tatlong beses, ang mga pulang selula ng dugo ay mahusay na hugasan. Matapos ang huling paghihiwalay ng supernatant, ang erythrocyte sediment sa halagang 0.1 ml ay halo-halong may 0.9 ml ng physiological solution. Ilapat ang 2-3 patak ng halo na ito sa isang glass slide at magdagdag ng isang patak ng Coombs serum. Ang pagkakaroon ng agglutination ay nagpapahiwatig na ang reaksyon ay positibo (positive direct Coombs test). Ang pag-aaral ay dapat isagawa sa temperatura ng silid na higit sa 16° upang maiwasan ang epekto ng malamig na agglutinin.

Hindi direktang pagsubok ng Coombs nagsisilbing katibayan ng pagkakaroon ng mga libreng antibodies sa maternal serum at ginagawa kasama ng maternal serum.

Ang hemolytic disease sa isang bagong panganak na may Rh incompatibility ay kadalasang nagpapakita ng sarili pagkatapos ng ikalawang pagbubuntis. Ang unang anak ay ipinanganak na malusog, ang pangalawa ay may mga palatandaan ng banayad na anemia, at pagkatapos lamang ng ikatlong pagbubuntis ay ang mga bata ay ipinanganak na may malinaw na mga palatandaan ng hemolytic disease. Tanging ang mga pre-sensitized na kababaihan lamang ang maaaring manganak ng isang bata na may mga sintomas ng hemolytic disease sa kanilang unang pagbubuntis. Sa ilang mga kaso, ang pagbabakuna ay nagdudulot ng mga pagpapalaglag at panganganak ng patay. Para sa simula at kalubhaan ng sakit, ang kondisyon ng inunan at ang tagal ng pagkakalantad ng maternal agglutinins sa fetus ay mahalaga. Kapag lumitaw ang mga agglutinin 10-14 na linggo bago ang kapanganakan, ang bata ay kadalasang nakakaranas ng mga subclinical form. Ang maagang paglitaw ng mga agglutinin, 15-26 na linggo bago ang kapanganakan, ay nagiging sanhi ng malubhang anyo ng sakit. Sa lahat ng anyo ng sakit, ang pangunahing proseso ay hemolysis. Ang kinahinatnan ng reaksyon ng antigen-antibody ay hemolysis, pinsala sa atay at mga capillary ng utak. Depende sa kung aling sugat ang nangingibabaw, ang iba't ibang anyo ng sakit ay sinusunod. Ang ilang mga anaphylactic phenomena ay mapanganib din. Ang mga ito ay humahantong sa pagbuo ng mga sangkap na tulad ng histamine, na nagiging sanhi ng matinding pinsala sa mga selula ng atay at lalo na sa mga selula ng ganglion ng basal ganglia, sungay ng ammon, medulla oblongata at maging ang cerebral cortex. Kapag nasira ang mga selula ng atay, ang hepatic jaundice ay idinaragdag sa extrahepatic jaundice. Ang mga bata ay namamatay dahil sa matinding sintomas ng kernicterus. Kung nakaligtas sila, nananatili ang mga sintomas ng pinsala sa sistema ng nerbiyos (mga karamdaman ng extrapyramidal system na may mga choreoathetotic na paggalaw, isang kakaibang lakad ng sayaw, sapilitang paggalaw ng ulo, kung minsan ay isang disorder ng koordinasyon ng mga boluntaryong paggalaw na may madalas na pagbagsak, pagtaas ng tono ng kalamnan, pag-iisip. retardation, ibig sabihin, may mga palatandaan ng tinatawag na encephalopatia posticteria infantum).

Antiglobulin test, o Coombs test Ginagawa ito upang matukoy ang ilang mga antibodies na umaatake sa mga pulang selula ng dugo (erythrocytes).

Ang mga antibodies ay mga protina na ginawa ng immune system. Karaniwan, ang mga antibodies ay nagbubuklod sa mga dayuhang sangkap tulad ng bakterya at mga virus at sinisira ang mga ito.

2. Bakit kailangan ng antibody test?

Ang pagsusuri sa antibody ay maaaring isagawa sa mga sumusunod na kaso:

Bago ang pagsasalin ng dugo

Marahil alam mo na ang isang tao ay maaaring magkaroon ng isa sa apat na uri ng dugo. At maaaring magsagawa ng antiglobulin test upang matukoy ang posibilidad ng pagsasalin ng dugo. Kung tumatanggap ka ng pagsasalin, ang dugo ng donor ay dapat tumugma sa iyong uri (may parehong antigens). Kung ang mga antigen ay iba sa panahon ng pagsasalin, sisirain ng immune system ang mga naisalin na selula. Ito ay maaaring humantong sa malubhang sakit at maging sa kamatayan. Ito ang dahilan kung bakit napakahalaga ng paghahanap ng tamang uri ng dugo.

Upang matukoy ang panganib ng Rh sensitization

Ang Rhesus ay isang antigen. Ang buong pangalan nito ay Rh factor. Ang Coombs test ay ginagamit upang makita ang mga antibodies sa Rh factor sa dugo ng mga buntis na kababaihan. Kung ang isang babaeng may negatibong Rh blood ay buntis ng isang bata na may positibong Rh factor (maaari itong maipasa mula sa ama), may panganib ng Rh sensitization. Ang Rh sensitization ay nangyayari kapag ang dugo ng sanggol ay naghalo sa dugo ng ina sa panahon ng pagbubuntis o panganganak. Kung ang uri ng dugo ng ina ay hindi tugma sa uri ng dugo ng sanggol, kung gayon ang kanyang immune system ay maaaring atakehin ang fetus, na nakikita ito bilang isang dayuhang bagay. Sa kasong ito, maaaring magkaroon ng malubhang sakit na tinatawag na erythroblastosis fetalis. Sa mga bihirang kaso, kung ang sakit ay hindi ginagamot, ang fetus o bagong panganak ay maaaring mamatay.

Ang isang babaeng may Rh negatibong dugo ay maaaring bigyan ng iniksyon ng anti-Rh gammaglobulin (hal. RhoGAM), na ginagamit upang maiwasan ang pagkakaroon ng Rh hemolytic disease.

Para sa diagnosis ng autoimmune hemolytic anemia

Ang autoimmune hemolytic anemia ay isang bihirang sakit na nauugnay sa pagbuo ng mga antibodies sa self-antigens ng mga pulang selula ng dugo.

3. Mga uri ng antiglobulin test

Mayroong dalawang uri ng antiglobulin test, o Coombs test: direkta at hindi direkta.

Direct Coombs test o direktang antiglobulin test nakakakita ng mga antibodies na nakagapos sa mga pulang selula ng dugo. Ito ay ginagamit upang matukoy ang anemia. Sa sakit na ito, ang mga pulang selula ng dugo ay nawasak nang mas mabilis kaysa sa paggawa nito.

Indirect Coombs test, o indirect antiglobulin test isinasagawa upang maghanap ng mga antibodies na hindi nauugnay sa mga pulang selula ng dugo. Ang pagsusuri ay gumagamit ng serum ng dugo, na naglalaman ng mga antibodies. Ang pamamaraang ito ay medyo bihira: ito ay pangunahing ginagawa upang matukoy ang posibilidad ng pagsasalin ng dugo o bilang isang yugto ng pagsusuri ng mga buntis na kababaihan.

4. Mga resulta ng reaksyon ng Coombs

pamantayan:

Negatibong resulta ng pagsubok - walang nakitang antibodies.

• Direktang pagsubok ng Coombs. Ang negatibong direktang pagsusuri ng antiglobulin ay nangangahulugan na ang iyong dugo ay walang mga antibodies na nauugnay sa mga pulang selula ng dugo.
• Hindi direktang pagsubok ng Coombs. Ang negatibong hindi direktang pagsusuri sa antiglobulin ay nangangahulugan na ang iyong dugo ay tugma sa dugo ng donor. Para sa isang buntis, ang resultang ito ay nangangahulugan na ang kanyang katawan ay hindi gumawa ng mga antibodies laban sa Rh-positive na uri ng dugo ng kanyang anak (Rh-sensitization ay hindi naganap).

Paglihis mula sa pamantayan:

• Direktang pagsubok ng Coombs. Ang isang positibong direktang pagsusuri sa antiglobulin ay nangangahulugan na ang iyong dugo ay may mga antibodies na lumalaban sa mga pulang selula ng dugo. Ito ay maaaring sanhi ng hindi tugmang pagsasalin ng dugo o mga sakit tulad ng hemolytic anemia o hemolytic disease ng bagong panganak (HDN).
• Hindi direktang pagsubok ng Coombs. Ang isang positibong hindi direktang pagsusuri sa antiglobulin ay nangangahulugan na ang iyong dugo ay hindi tugma sa dugo ng donor. Sa isang buntis, ang mga resulta ay nangangahulugan ng pagkakaroon ng mga antibodies laban sa positibong Rh factor ng dugo ng bata (Rh sensitization). Kung ang sanggol ay may positibong Rh factor, ang ina ay mahigpit na susubaybayan ng isang doktor sa buong pagbubuntis.

O natunaw sa plasma.

kasingkahulugan: antiglobulin test, Coombs test, AGT, indirect/direct antiglobulin test, IAT, NAT, DAT, indirect/direct Coombs test

Ang pagsusulit ng Coombs ay

isang pagsusuri na nakakakita ng pagbabakuna at mga antibodies sa mga pulang selula ng dugo.

Mga uri ng pagsubok sa Coombs

• direktang pagsubok ng Coombs– nakakakita ng mga antibodies na naayos sa ibabaw ng mga pulang selula ng dugo. Isinasagawa ito kung pinaghihinalaang autoimmune hemolytic anemia, hemolysis sa mga autoimmune disease, pagkatapos kumuha ng mga gamot (methyldopa, penicillin, quinine), pagkatapos ng pagsasalin ng dugo at hemolytic disease ng bagong panganak.

Ang mga pulang selula ng dugo ay na-sensitize sa vivo - ang mga antibodies ay mahigpit na nakakabit sa kanila, at ang pagdaragdag ng antiglobulin serum (anti-IgG) ay nagiging sanhi ng pagdikit ng mga sensitibong selula, na nakikita ng mata.

• hindi direktang pagsubok ng Coombs– nakakakita ng mga anti-erythrocyte antibodies sa plasma ng dugo, na ginawa bago ang pagsasalin ng dugo at sa panahon ng pagbubuntis.

Ang mga anti-erythrocyte antibodies ay isang uri ng mga autoantibodies, i.e. antibodies laban sa iyong sariling mga tisyu. Ang isang autoantibody ay nangyayari kapag ang immune system ay abnormal na tumugon sa ilang mga gamot, tulad ng mataas na dosis ng penicillin.

Ang mga pulang selula ng dugo sa kanilang ibabaw ay naglalaman ng iba't ibang mga istrukturang kemikal (glycolipids, saccharides, glycoproteins at mga protina), sa gamot na tinatawag na antigens. Ang isang tao ay nagmamana mula sa kanyang mga magulang ng isang tiyak na mapa ng mga antigen sa bawat pulang selula ng dugo.

Ang mga antigen ay pinagsama sa mga grupo at sa tabi nito ang dugo ay nahahati sa ilang mga grupo - ayon sa AB0 system, Rhesus, Kell, Lewis, Kidd, Duffy. Ang pinakatanyag at makabuluhan sa gawain ng isang doktor ay ang AB0 at ang Rh factor (Rh).

Sistema ng AB0

Rhesus na kaakibat ang isang tao ay natutukoy sa pamamagitan ng pagkakaroon ng mga antigen na ito. Ang isang partikular na mahalagang antigen ng mga erythrocytes ay ang antigen D. Kung ito ay naroroon, pagkatapos ay nagsasalita sila ng Rh-positibong dugo RhD, at kung ito ay wala, pagkatapos ay nagsasalita sila ng Rh-negatibong Rhd na dugo.

Kung ang kaukulang antibody ay nakakabit sa mga erythrocyte antigens, ang erythrocyte ay nawasak - hemolyzes.

Mga pahiwatig para sa paggamit direktang pagsusuri ng antiglobulin

• pangunahing autoimmune hemolytic anemia
• hemolytic anemia sa autoimmune, tumor, mga nakakahawang sakit
• autoimmune hemolytic anemia na dulot ng droga
• post-transfusion hemolytic anemia (mga araw - buwan)
• hemolytic disease ng bagong panganak (hindi pagkakatugma ng isa sa mga pangkat ng dugo)

Mga pahiwatig para sa paggamit hindi direktang pagsusuri ng antiglobulin

• bago magsalin ng dugo
• sa panahon ng pagbubuntis ng isang Rh-negative na babae

Autoimmune hemolytic anemia

Autoimmune hemolytic anemia (pangunahing)– isang klasikong sakit na autoimmune na may hindi kilalang dahilan. Ipinapalagay na mayroong pagkagambala sa proseso ng pakikipag-ugnayan sa antas ng immune system, na humahantong sa pang-unawa ng sariling mga pulang selula ng dugo bilang dayuhan. Ang mga cell ay gumagawa ng mga antibodies ng klase ng IgG (reaksyon sa t 37°C) at/o IgM (sa t 40°C), na nakakabit sa ibabaw ng erythrocyte, na nagpapalitaw ng isang bilang ng mga enzyme (ang sistema ng pandagdag) at "pagbutas" ang pader ng erythrocyte, na humahantong sa pagkasira nito - hemolysis.

Mga sintomas ng hemolytic anemia

• pagkapagod, pangkalahatang kahinaan, pagkamayamutin
• dyspnea
• pananakit ng tiyan, pagduduwal
• madilim na kulay ng ihi
• sakit ng likod
• icteric discoloration ng balat at mauhog lamad
• pinalaki ang atay, pali
• pagbaba sa bilang ng mga pulang selula ng dugo at hemoglobin sa isang pangkalahatang pagsusuri sa dugo

Positibong resulta direkta Mga pagsusulit sa Coombs Kinukumpirma ng 100% ang diagnosis ng autoimmune hemolytic anemia, na nagpapatunay sa pinagmulan ng autoimmune nito. Kasabay nito, ang isang negatibong resulta ay hindi ginagawang posible na alisin ang diagnosis.

Ang pangalawang autoimmune hemolytic anemia at isang positibong pagsusuri sa Coombs ay maaaring mangyari sa mga sumusunod na sakit:

• systemic lupus erythematosus
• Evans syndrome
• Ang macroglobulinemia ng Waldenström
• paroxysmal cold hemoglobinuria
• talamak na lymphocytic leukemia
• mga lymphoma
• nakakahawang mononucleosis
• Impeksyon sa Mycoplasma pneumoniae
• syphilis

Ang positibong antiglobulin test para sa mga sakit na ito ay hindi nagsisilbing diagnostic criterion, ngunit isa sa mga sintomas ng sakit.

Hemolytic disease ng bagong panganak

Dahilan hemolytic disease ng mga bagong silang - hindi pagkakatugma ng mga pangkat ng dugo sa ina at fetus, sa karamihan ng mga kaso ayon sa sistema ng Rh, sa mga solong kaso - ayon sa sistema ng AB0, sa kaswal na paraan - ayon sa iba pang mga antigens.

Ang Rh conflict ay nabubuo kung ang fetus ng isang Rh-negative na babae ay nagmamana ng Rh-positive na dugo mula sa ama.

Ang sakit ay bubuo sa isang bagong panganak lamang kung ang ina ay nakabuo na ng mga antibodies sa kaukulang antigens, na nangyayari pagkatapos ng mga nakaraang pagbubuntis, panganganak, pagpapalaglag, at hindi tugmang pagsasalin ng dugo. Ang pinakakaraniwang dahilan para sa pag-trigger ng synthesis ng mga antibodies sa antigens ng erythrocyte membrane ay ang panganganak (feto-maternal bleeding). Ang unang kapanganakan ay karaniwang nagaganap nang walang mga komplikasyon, ngunit ang mga kasunod ay puno ng hemolytic disease ng bagong panganak sa mga unang araw pagkatapos ng kapanganakan.

Mga sintomas ng hemolytic disease ng bagong panganak

• paninilaw ng balat
• anemya
• pamumutla ng balat at mga mucous membrane
• pinalaki ang atay at pali
• mga problema sa paghinga
• pamamaga ng buong katawan
• paggulo at unti-unting pagkalumbay ng central nervous system

Anemia pagkatapos ng pagsasalin ng dugo

Hindi direktang pagsubok ng Coombs isinasagawa bago ang pagsasalin ng dugo upang masuri ang pagiging tugma, at direktang pagsubok ng Coombs- pagkatapos nito, kung pinaghihinalaang post-transfusion hemolysis, i.e. kung mayroon kang mga sintomas tulad ng lagnat, panginginig, pagdidilig (basahin sa ibaba). Ang layunin ng pagsusuri ay upang matukoy ang mga antibodies sa nasalin na mga pulang selula ng dugo na nakagapos sa mga pulang selula ng dugo ng tatanggap at ang sanhi ng post-transfusion hemolysis, pati na rin ang maagang pag-alis ng mga donor red blood cell mula sa sirkulasyon ng dugo ng ang tatanggap (ang tumanggap ng dugo).

Mga sintomas ng hemolytic reaction pagkatapos ng pagsasalin ng dugo

• pagtaas ng temperatura ng katawan
• pantal sa balat
• sakit ng likod
• pulang kulay ng ihi
• pagduduwal
• pagkahilo

Pag-decode ng Coombs test

Ito ay nagkakahalaga ng pag-alala na ang mga pangunahing patakaran para sa pag-decode ng direkta at hindi direktang mga pagsusuri sa antiglobulin ay pareho. Ang pagkakaiba lamang ay ang lokasyon ng mga antibodies - sa dugo o nasa pulang selula ng dugo - sa pulang selula ng dugo.

• Kung Ang direktang pagsusuri sa Coombs ay negatibo– ito ay nangangahulugan na ang antibody ay hindi "umupo" sa mga pulang selula ng dugo at ang sanhi ng mga sintomas ay kailangang hanapin pa at ang isang hindi direktang pagsusuri sa Coombs ay dapat gawin
• kung ang isang positibong resulta ng pagsusuri ng Coombs ay nakita pagkatapos ng pagsasalin ng dugo, mga impeksyon, mga gamot - ang pagiging positibo ay maaaring tumagal ng hanggang 3 buwan (ang buhay ng mga pulang selula ng dugo ay 120 araw - 3 buwan)
• ang isang positibong resulta ng pagsusuri sa antiglobulin para sa isang sakit na autoimmune ay maaaring tumagal ng mga buwan o kahit na taon

Mga pamantayan sa pagsubok ng Coombs

• direktang pagsubok ng Coombs- negatibo
• hindi direktang pagsubok ng Coombs- negatibo

Ang isang qualitatively positive na resulta ay sinusukat sa bilang ng mga plus mula isa hanggang apat (+, ++, +++, ++++), at quantitatively sa digital form - 1:16, 1:256, atbp.

4 na katotohanan tungkol sa pagsusulit ng Coombs

• unang iminungkahi sa Cambridge noong 1945
• threshold ng sensitivity - hindi bababa sa 300 nakapirming molekula ng antibody sa isang pulang selula ng dugo
• ang bilang ng mga antibodies na nagpapalitaw ng hemolysis - isa-isa para sa bawat tao (mula 16-30 hanggang 300)
• ang dynamics ng iba pang mga laboratory indicator ng hemolytic anemia (hemoglobin, bilirubin, reticulocytes) ay maaaring mag-normalize, at ang Coombs test ay mananatili sa parehong antas

Mga disadvantages ng antiglobulin test

• hindi matukoy ang lakas ng pagbubuklod ng isang antigen sa isang antibody
• hindi kilalang bilang ng mga antibodies na nakatali
• hindi tinutukoy ang uri ng antibody
• ang isang positibong pagsusuri sa Coombs ay hindi makakatulong na matukoy ang sanhi nito
• 0.5% ng malulusog na tao ang may positibong pagsusuri sa Coombs nang walang anumang senyales ng hemolytic anemia
• hindi angkop para sa pagsubaybay sa tagumpay ng paggamot, dahil hindi nito ipahiwatig ang aktibidad ng erythrocyte hemolysis

Naaprubahan sa pamamagitan ng pagkakasunud-sunod ng Roszdravnadzor

sa paggamit ng "Set of reagents para sa pagtukoy ng mga antigen at antibodies ng Rhesus system sa dugo ng tao"
(AGS para sa pagsusulit ng Coombs)

TU 9398-102-51203590-2012

RU No. RZN 2013/1255 na may petsang 10/11/2013

I. PANIMULA

Ang karaniwang serum para sa pagsusulit ng Coombs ay naglalaman ng mga partikular na heteroimmune antibodies laban sa mga protina ng dugo ng tao at nilayon para gamitin sa dalawang opsyon sa reaksyon - direkta at hindi direktang pagsusuri ng Coombs.

Direktang pagsubok ng Coombs ginagamit upang matukoy ang sensitization ng mga erythrocytes sa vivo sa hemolytic disease ng mga bagong silang at sa mga pasyente na may autoimmune form ng talamak na hemolytic anemia, pati na rin sa ilang iba pang mga kondisyon. Nagsasagawa ng direktang pagsusuri sa Coombs Binubuo ang katotohanan na ang suwero para sa pagsusuri ng Coombs ay idinagdag sa mga pulang selula ng dugo sa ilalim ng pag-aaral, na dating hugasan mula sa mga protina ng kanilang sariling plasma. Kung ang mga pulang selula ng dugo ay na-sensitize sa vivo, ang reaksyon ay nagreresulta sa kanilang aglutinasyon.

Hindi direktang pagsubok ng Coombs ginamit bilang isang pagsubok upang matukoy ang estado ng sensitization ng katawan, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng mga antibodies na nasa isang libreng estado sa serum ng dugo ng taong sinusuri; bilang isang pagsubok para sa pagiging tugma ng nasalin na dugo, kapag ang epekto ng serum ng tatanggap sa mga pulang selula ng dugo ng nilalayong donor ay napagmasdan; at bilang isang pagsubok para sa pagtukoy ng iba't ibang grupong antigens sa mga erythrocytes gamit ang paunang pagkakalantad sa karaniwang sera na naglalaman ng mga antibodies na alam ang pagiging tiyak. Indirect Coombs test (lahat ng opsyon) ginawa sa dalawang yugto, ang una ay ang incubation ng test (o standard) serum na may standard (o test) erythrocytes, i.e. sensitization ng erythrocytes in vitro. Ang ikalawang yugto ay ang aktwal na reaksyon sa serum para sa Coombs test, na ginagawa sa parehong paraan tulad ng direktang Coombs test.

Ang huling resulta ng reaksyon sa parehong direkta at hindi direktang pagsusuri ng Coombs ay nangyayari dahil sa pakikipag-ugnayan ng karaniwang serum para sa pagsusuri ng Coombs sa mga antibodies (protein ng dugo ng tao) na naayos sa mga pulang selula ng dugo. Ang resulta na ito ay nagpapakita ng sarili bilang agglutination ng mga pulang selula ng dugo. Upang obserbahan ang agglutination, dapat kang gumamit ng isang puting porselana o anumang puting plato na may nababasang ibabaw upang ang mga patak na inilapat dito ay mahusay na pinaghalo at hindi kumalat sa ibabaw ng plato. Ang mga halo-halong patak ay dapat na bahagyang ikalat sa ibabaw ng plato, humigit-kumulang sa laki ng isang 2-kopeck na barya.
II. PAGHAHANDA NG REACTION INGREDIENTS

Ang test serum upang matukoy ang presensya at pagtitiyak ng mga antibodies dito ay nakuha mula sa dugo ng taong sinusuri nang walang pagdaragdag ng pang-imbak. Mag-imbak sa temperatura na + 4–8 0 C nang hindi hihigit sa 2 araw o nagyelo sa loob ng 1 buwan.

Ang serum para sa pagsubok sa pagiging tugma ay nakuha sa parehong paraan, ngunit ginagamit sa istante ng buhay na hindi hihigit sa 2 araw.

Ang mga pulang selula ng dugo na inilaan para sa pagtukoy ng ilang mga isoantigens sa kanila ay inihanda na may ilang uri ng pang-imbak mula sa taong sinusuri ang dugo. Maaari mo ring gamitin ang red blood cell sediment mula sa dugong kinuha nang walang preservative.

Kapag sinusuri ang pagiging tugma, ang donor na dugo ay ginagamit, na inilabas sa pamamagitan ng isang karayom ​​mula sa isang vial na inihanda para sa pagsasalin ng dugo.

Sa lahat ng kaso, ang mga pulang selula ng dugo ay hinuhugasan ng 3-4 na beses sa mga test tube mula sa plasma sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 8-10 volume ng isotonic sodium chloride solution sa isang volume ng red blood cell, na sinusundan ng paghahalo at centrifugation sa 1500-2000 rpm para sa 5- 10 minuto (hanggang sa kumpletong erythrocyte sedimentation). Pagkatapos ng bawat centrifugation, sinisipsip ang supernatant.
III. MGA REACTION TECHNIQUE

Ang mga test erythrocytes ay inihanda sa anyo ng isang 5% na suspensyon, kung saan ang isang patak ng erythrocytes na hugasan ng apat na beses ay halo-halong sa isang test tube na may 19 na patak ng isotonic sodium chloride solution.

Ang isang patak (0.05 ml) ng 5% na suspensyon ng mga pulang selula ng dugo ay inililipat sa isang puting plato at pinahiran. Ang plato ay inuuga at inoobserbahan sa loob ng 3 minuto upang makita kung naganap ang agglutination ng mga pulang selula ng dugo. Kung hindi nangyari ang agglutination, pagkatapos ay magdagdag ng 1-2 patak ng karaniwang serum para sa pagsubok ng Coombs, paghaluin ang mga patak nang lubusan, pagkatapos ay bahagyang iling ang plato, pagkatapos ay iwanan ito nang mag-isa para sa isa o dalawang minuto at iling muli. Kasabay nito, ang resulta ay sinusubaybayan sa loob ng 10 minuto, na ipinahayag sa pagkakaroon o kawalan ng agglutination.
Interpretasyon ng mga resulta ng direktang pagsusulit ng Coombs.

Walang agglutination - negatibong pagsubok

Pagkakaroon ng agglutination – isang positibong pagsusuri, na nagpapahiwatig ng sensitization ng mga pulang selula ng dugo na sinusuri, ibig sabihin, ang pagsipsip ng mga antibodies sa kanila, na naganap sa vivo sa katawan ng tao (bagong panganak, pasyente). Kung agglutination ng nasubok na mga pulang selula ng dugo nangyari bago idagdag serum para sa pagsubok ng Coombs; ang resulta ng direktang pagsusuri ay hindi isinasaalang-alang.
2. Hindi direktang pagsubok ng Coombs

Idinisenyo upang makita ang mga isoantibodies sa serum ng dugo ng paksa

Ito ay ginagamit sa mga kaso kung saan ito ay kinakailangan upang malaman kung ang dugo ng isang pasyente, buntis na babae, donor, atbp ay naglalaman ng isoimmune antibodies ng hindi kumpletong anyo at upang maitaguyod ang kanilang pagtitiyak. Para sa reaksyon, ginagamit ang serum ng dugo ng taong sinusuri at karaniwang mga pulang selula ng dugo na alam ang pagiging tiyak. Kabilang sa 8-10 o higit pang mga sample ng red blood cell na ito ay dapat mayroong mga pagkakaiba sa mga salik mula sa iba pang mga system at napakahalaga na ang bawat isa sa mga salik na ito ay nakapaloob sa hindi bababa sa isang sample ng pulang selula ng dugo. Kasama rin sa panel ang mga sample ng Rh-negative erythrocytes na may iba't ibang kumbinasyon ng mga antigens ng iba pang mga system, upang kabilang sa mga ito ay mayroong Duffy-positive at Duffy-negative, na, naman, ay nahahati sa Kell-positive at Kell-negative, Kidd-positive at Kidd-negative, atbp. Bilang negatibong kontrol, kung maaari, ang mga erythrocytes ng taong sinusuri ang serum ay kasama sa reaksyon.

Teknik ng reaksyon

Ang isang bilang ng centrifuge o iba pang mga tubo na may dami na 3-10 ml ay naka-install sa isang stand, ayon sa bilang ng mga sample ng erythrocyte na kasama sa reaksyon. Ang mga tubo ay may label at, ayon sa pagmamarka, 1 maliit na patak (0.01 ml) ng hugasan na karaniwang mga pulang selula ng dugo ay idinagdag sa kanila. Tatlong patak ng test serum ang ibinabagsak sa bawat test tube, ang mga test tube ay inalog nang masigla upang paghaluin ang mga pulang selula ng dugo sa serum at inilagay sa thermostat sa 37 0 C sa loob ng 45 minuto. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang mga tubo ay aalisin mula sa termostat, at ang mga pulang selula ng dugo ay hugasan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng isotonic sodium chloride solution sa tuktok ng tubo, paghahalo at kasunod na sentripugasyon. Ang paghuhugas ay paulit-ulit ng 3-4 na beses, sa bawat oras na maingat na sinipsip ang supernatant, pagkatapos ay 2 patak ng isotonic sodium chloride solution ay idinagdag sa hugasan na mga pulang selula ng dugo upang makakuha ng humigit-kumulang 5% ng suspensyon (kapag gumagamit ng mga centrifuge tubes, maaari mong limitahan ang iyong sarili sa paghuhugas ng dalawang beses).

Ang 1 patak ng 5% na suspensyon ng mga erythrocytes mula sa bawat test tube ay inililipat sa isang puting plato, 1-2 patak ng karaniwang serum para sa pagsubok ng Coombs ay idinagdag doon at ang serum ay lubusang hinaluan ng mga erythrocytes. Ang plato ay bahagyang inalog, pagkatapos ay iwanan nang mag-isa sa loob ng 1-2 minuto at pana-panahong inalog muli, habang sabay na sinusunod ang resulta ng reaksyon sa loob ng 20 minuto.

Interpretasyon ng mga resulta

Walang mga palatandaan ng aglutinasyon (negatibong resulta) sa lahat ng sample ay nangangahulugan na ang test serum ay hindi naglalaman ng mga hindi kumpletong antibodies sa grupong antigens na nakapaloob sa karaniwang mga pulang selula ng dugo na kasama sa pag-aaral.

Kung sa ilan o karamihan sa mga patak, bilang karagdagan sa kontrol, sinusunod aglutinasyon , nangangahulugan ito na ang test serum ay naglalaman ng hindi kumpletong antibodies laban sa erythrocyte antigens. Ang tanong ng pagiging tiyak ng mga antibodies na ito ay napagpasyahan sa pamamagitan ng paghahambing ng mga positibo at negatibong reaksyon sa antigenic na istraktura ng mga pulang selula ng dugo na kasama sa reaksyon. Ang tanong ng aktibidad ng mga antibodies na ito ay nalutas sa pamamagitan ng titration.

Halimbawa 1. Naganap ang aglutinasyon kasama ang lahat ng mga sample ng erythrocytes na naglalaman ng Rh 0 (D) factor, anuman ang presensya o kawalan ng iba pang mga kadahilanan ng system na ito at iba pang mga system, habang sa lahat ng Rh 0 (D) na mga negatibong sample ay walang naobserbahang agglutination (kaya't anuman ang ang pagkakaroon o kawalan ng iba pang mga kadahilanan) - nangangahulugan ito na ang test serum ay naglalaman ng hindi kumpletong anti-Rhesus antibodies - Rh 0 (D).

Halimbawa 2. Naganap ang aglutination kasama ang lahat ng mga sample ng erythrocytes na naglalaman ng Duffy factor, anuman ang pagkakaroon o kawalan ng mga antigens ng Rhesus system at iba pang mga system, habang walang agglutination ang naobserbahan sa lahat ng Duffy-negative na sample, na nangangahulugan na ang test serum ay naglalaman ng hindi kumpletong anti- antibodies. -Duffy.

Dagdag. Kung ang institusyon ay walang kumpletong panel ng karaniwang mga pulang selula ng dugo, ngunit may pangangailangan na subukan ang serum para sa pagkakaroon ng mga antibodies, inirerekomenda na magsagawa ng isang pag-aaral na may 25-30 random na mga sample ng mga pulang selula ng dugo mula sa malusog na mga indibidwal ng pangkat 0 (I) o ang serum na may parehong pangalan bilang test serum. Gagawin nitong posible na malutas ang isyu ng pagkakaroon o kawalan ng mga antibodies sa karamihan ng mga antigen ng Rh-Hr, Duffy, Kell, Kidd system.

Kung ang isang positibong resulta ay nakuha, ang karagdagang konklusyon tungkol sa pagiging tiyak ng mga nakitang antibodies ay maaaring mapagpasyahan ng isang espesyal na pag-aaral na may isang buong panel ng karaniwang mga pulang selula ng dugo.

3. Teknik para sa pagsasagawa ng indirect Coombs test bilang isang pagsubok para sa compatibility ng nasalin na dugo

Upang maiwasan ang hindi pagkakatugma sa panahon ng pagsasalin ng dugo, ang mga sumusunod na pagsusuri sa pagiging tugma ay dapat gawin bago ang pagsasalin:

1. 
   Isang pagsubok sa pagiging tugma para sa mga pangkat ng dugo ng ABO, na ginagawa sa isang eroplano sa temperatura ng silid.
2. 
   Mga pagsubok sa pagiging tugma para sa Rh factor at iba pang isoantigens.

Ang hindi pagkakatugma para sa Rh factor at ilang iba pang isoantigens ay maaaring depende sa pagkakaroon ng kumpletong antibodies (natukoy sa isang saline na kapaligiran sa 37 0 C sa mga test tube) at, kadalasan, sa mga hindi kumpletong antibodies, kung saan ang hindi direktang pagsusuri ng Coombs ay ang pinaka. sensitibo.

Ang isang maliit (0.01 ml) na patak ng hugasan na donor erythrocytes, na kinuha sa pamamagitan ng isang karayom ​​mula sa isang bote ng dugo na inilaan para sa pagsasalin, ay inilipat sa ilalim ng isang centrifuge o iba pang tubo na may dami ng 3-4 ml at 3 patak ng pasyente. Ang serum ay idinagdag dito. Ang test tube ay inalog upang paghaluin ang mga erythrocytes sa suwero, pagkatapos nito ay ilagay sa isang thermostat sa 37 0 C sa loob ng 45 minuto. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, isang isotonic sodium chloride solution ay idinagdag sa tuktok ng test tube, ang mga nilalaman ng test tube ay halo-halong at centrifuge sa loob ng 5-10 minuto. Ang paghuhugas na ito ng mga pulang selula ng dugo ay inuulit ng 3 beses, sa bawat oras na maingat na inaalis ang supernatant. Kapag gumagamit ng centrifuge tubes, maaari mong limitahan ang iyong sarili sa paghuhugas ng dalawang beses. Magdagdag ng 2 patak ng isotonic sodium chloride solution sa hugasan na pulang selula ng dugo upang makakuha ng humigit-kumulang 5% na suspensyon.

Ang 1 patak ng 5% na suspensyon ng mga pulang selula ng dugo ay inililipat sa isang puting plato, 1-2 patak ng karaniwang serum para sa pagsusuri ng Coombs ay idinagdag doon at ang serum ay lubusang hinaluan ng mga pulang selula ng dugo. Pagkatapos ang plato ay bahagyang inalog, iniwan nang mag-isa sa loob ng 1-2 minuto at pana-panahong inalog muli, habang sinusunod ang resulta sa loob ng 20 minuto.

Tandaan: Sa kaso ng Rh incompatibility, ang agglutination ay kadalasang nangyayari sa loob ng unang minuto, ngunit may mababang titer ng Rh antibodies (o iba pang antibodies), ang agglutination ay maaaring mangyari mamaya, minsan sa ikadalawampung minuto.
Interpretasyon ng resulta:

Nakikita ang mga aglutinate sa anyo ng mga bukol sa isang clear o ganap na bleached background - nangangahulugan ito na ang dugo ng donor hindi magkatugma kasama ang dugo ng tatanggap at hindi maisalin sa kanya.

kawalan ang mga palatandaan ng aglutinasyon ay nangangahulugan na ang dugo ng pasyente ay hindi naglalaman ng mga hindi kumpletong antibodies sa mga pulang selula ng dugo ng donor na may kaugnayan sa Rh factor at iba pang isoantigens kung saan maaaring mabuo ang mga hindi kumpletong antibodies.

Ang hindi direktang pagsusuri ng Coombs ay sensitibo lamang para sa mga hindi kumpletong antibodies.
4. Indirect Coombs test technique para sa pagtukoy ng antigenic na istraktura ng erythrocytes

Ginagamit ang pagsusulit na ito upang matukoy ang presensya o kawalan ng anumang antigen ng pangkat ng pulang selula ng dugo gamit ang karaniwang serum na naglalaman ng kaukulang mga antibodies sa hindi kumpletong anyo.

Kadalasan, ang hindi direktang pagsubok ng Coombs ay ginagamit upang matukoy ang mga antigen na Kell (K), Duffy (Fy), Kidd (Jk), at upang matukoy din ang mahinang antigen ng Rh system (Du).

Bago magpatuloy sa pagtukoy ng mga antigen, ang mga pulang selula ng dugo sa ilalim ng pag-aaral ay dapat na masuri sa isang direktang pagsusuri sa Coombs. Kung ang resulta ng isang direktang pagsusuri ay positibo, ang pagpapasiya ng mga antigen sa pamamagitan ng isang hindi direktang pagsusuri ng Coombs ay hindi maaaring isagawa at ang iba pang mga reaksyon ay dapat gamitin para sa layuning ito.

Para sa reaksyon, ang centrifuge o iba pang mga tubo na may dami na 3-4 ml ay ginagamit sa halagang tatlo: isa para sa pagsubok na sample ng mga erythrocytes at dalawa para sa 1 maliit (0.01 ml) na patak ng tatlong beses na hugasan na mga test erythrocytes ay idinagdag sa sa ilalim ng unang tubo, ang mga control erythrocytes ay idinagdag sa pangalawang tubo, na naglalaman ng nais na antigen (halimbawa, Duffy-positive) at sa ikatlong tubo - negatibong kontrol (Duffy-negatibo). Magdagdag ng 2-3 patak ng karaniwang serum (sa halimbawang ito, anti-Duffy) sa lahat ng test tubes. Ang mga test tube ay inalog upang paghaluin ang mga nilalaman at inilagay sa isang thermostat sa 37 0 C sa loob ng 45 minuto. Pagkatapos ng naturang pagpapapisa ng itlog, ang mga test tube ay tinanggal mula sa termostat, isang isotonic sodium chloride solution ay idinagdag sa itaas, ang mga nilalaman ay lubusan na halo-halong at centrifuge sa 1500-2000 thousand rpm sa loob ng 5-10 minuto. Pagkatapos ng centrifugation, ang supernatant ay maingat na sinipsip at ang paghuhugas ng mga pulang selula ng dugo ay paulit-ulit ng 4 na beses. (Kapag gumagamit ng centrifuge tubes, maaari mong limitahan ang iyong sarili sa paghuhugas ng dalawang beses).

Magdagdag ng 2 patak ng isotonic sodium chloride solution sa hugasan na pulang selula ng dugo upang makakuha ng humigit-kumulang 5% na suspensyon. 1 drop ng 5% suspension ng erythrocytes mula sa bawat test tube ay inililipat sa isang puting plato, 1-2 patak ng standard serum para sa Coombs test ay idinagdag sa bawat drop ng erythrocytes at halo-halong. Ang plato ay bahagyang inalog, pagkatapos ay iwanan nang mag-isa sa loob ng 1-2 minuto at pana-panahong inalog muli, habang sabay na sinusunod ang pag-unlad ng reaksyon sa loob ng 20 minuto.
Interpretasyon ng mga resulta

Pagkakaroon ng agglutination ang mga pulang selula ng dugo (positibong resulta) ay nangangahulugan na ang dugo ay naglalaman ng ninanais na antigen (sa halimbawang ito, Duffy-positive na dugo).

Walang agglutination (negatibong resulta) ay nangangahulugan na ang nasuri sa dugo ay hindi naglalaman ng nais na antigen (Duffy negatibo).

Ang resulta ay isinasaalang-alang bilang totoo pagkatapos suriin ang mga control sample, ibig sabihin, sa halimbawa, kung ang resulta ay positibo sa Duffy-positive sample at negatibo sa Duffy-negative na sample.

5. Release form

Ang reagent ay magagamit sa likidong anyo sa mga bote ng 5 o 10 ml (1 ml ay naglalaman ng 10 dosis). Ang sodium azide ay ginagamit bilang isang pang-imbak sa isang pangwakas na konsentrasyon na 0.1%.

6.Imbakan

Shelf life: dalawang taon sa refrigerator sa 2-8°C. Ang isang bukas na bote ay angkop para sa paggamit kapag naka-imbak sa refrigerator, hermetically sealed, para sa buong petsa ng pag-expire.

Ang mga batayan para sa reklamo ay: kakulangan ng aktibidad, hindi tiyak, paglabag sa integridad ng bote, pagkakaroon ng mga natuklap, nag-expire na reagent. Kapag nagrereklamo, mangyaring isaad ang petsa ng pagtanggap, ang supplier (kung natanggap mo ang produkto hindi mula sa tagagawa), ang numero ng batch, at ang mga dahilan kung bakit nakitang hindi angkop ang reagent. Mangyaring maglakip ng isang protocol na may mga resulta ng pagsubok sa reagent at 2-3 hindi pa nabubuksang bote na may reagent
Ang reklamo ay dapat ipadala sa tagagawa LLC "MEDICLON": 127276

Mga antibodies, na matatagpuan sa ibabaw ng mga erythrocytes, ay maaaring nasa static o libreng estado sa plasma ng dugo. Depende sa estado ng mga antibodies, ang isang direkta o hindi direktang reaksyon ng Coombs ay isinasagawa. Kung may dahilan upang maniwala na ang mga antibodies ay naayos sa ibabaw ng mga pulang selula ng dugo, isang direktang pagsusuri sa Coombs ay isinasagawa. Sa kasong ito, ang pagsubok ay nagaganap sa isang yugto - pagdaragdag antiglobulin serum. Kung ang mga hindi kumpletong antibodies ay naroroon sa ibabaw ng mga pulang selula ng dugo, aglutinasyon pulang selula ng dugo

Hindi direktang reaksyon

Ang hindi direktang reaksyon ng Coombs ay nangyayari sa 2 yugto. Una kailangan mong artipisyal na ipatupad sensitization pulang selula ng dugo Upang gawin ito, ang mga pulang selula ng dugo at ang serum ng dugo na sinusuri ay incubated, na nagiging sanhi ng pag-aayos ng mga antibodies sa ibabaw ng mga pulang selula ng dugo. Pagkatapos kung saan ang ikalawang yugto ng pagsubok ng Coombs ay isinasagawa - ang pagdaragdag ng antiglobulin serum.

Reaksyon ng ulan - Ang RP (mula sa Latin na praecipilo to precipitate) ay ang pagbuo at pag-ulan ng isang complex ng natutunaw na molekular antigen na may mga antibodies sa anyo ng cloudiness, na tinatawag na umuulan. Ito ay nabuo sa pamamagitan ng paghahalo ng mga antigen at antibodies sa katumbas na dami; Ang reaksyon ng pag-ulan ay ginagawa sa mga test tubes (ring precipitation reaction), sa mga gel, nutrient media, atbp. Mga uri ng precipitation reaction sa isang semi-liquid agar o agarose gel, double immunodiffusion sa pamamagitan ng Ouchterlony, radiap immunodiffusion, immunoepectrophoresis atbp.

Reaksyon ng pag-ulan ng singsing. Ang reaksyon ay isinasagawa sa makitid na mga tubo ng pag-ulan: isang natutunaw na antigen ay naka-layer sa immune serum. Sa pinakamainam na ratio ng antigen at antibodies, ang isang opaque na layer ay nabuo sa hangganan ng dalawang solusyon na ito..
Kung ang pinakuluang at na-filter na tissue extract ay ginagamit bilang antigens sa reaksyon, kung gayon ang reaksyong ito ay tinatawag na unang thermoprecipitation reaction (ang reaksyon kung saan ang anthrax hapten ay nakita). Ouchterlony double immunodiffusion reaksyon
. Upang i-set up ang reaksyon, ang isang manipis na layer ng tinunaw na agar gel ay ibinuhos sa isang glass plate at pagkatapos ng hardening, ang mga balon ay pinutol dito.
Ang mga antigen at immune sera ay inilalagay nang hiwalay sa mga balon ng gel, na nagkakalat sa isa't isa. Sa tagpuan, sa katumbas na proporsyon, bumubuo sila ng isang namuo sa anyo ng isang puting guhit. Sa mga multicomponent system, lumilitaw ang ilang linya ng precipitate sa pagitan ng mga balon na may mga antigen at antibodies; sa magkatulad na mga AG, ang mga namuong linya ay nagsasama; sa mga hindi magkaparehong AG ay nagsalubong sila. Radial immunodiffusion reaksyon.
Ang immune serum na may molten agar gel ay ibinuhos nang pantay-pantay sa baso. Pagkatapos ng solidification sa gel, ang mga balon ay ginawa kung saan inilalagay ang antigen sa iba't ibang mga dilution. Ang antigen, na nagkakalat sa gel, ay bumubuo ng mga hugis-singsing na precipitation zone sa paligid ng mga balon na may mga antibodies. Ang diameter ng precipitation ring ay proporsyonal sa konsentrasyon ng antigen.

Ang reaksyon ay ginagamit upang matukoy ang mga immunoglobulin ng iba't ibang klase, mga bahagi ng sistema ng pandagdag, atbp. sa serum ng dugo. Immunoelectrophoresis

- isang kumbinasyon ng electrophoresis at immunoprecipitation: isang halo ng mga antigens ay ipinakilala sa mga balon ng gel at pinaghiwalay sa gel gamit ang electrophoresis, pagkatapos ay idinagdag ang immunoserum sa uka na kahanay sa mga electrophoresis zone, ang mga antibodies na nagkakalat sa gel at bumuo ng mga linya ng pag-ulan sa lugar ng "pagpupulong" sa antigen. Reaksyon ng flocculation ay maaaring maging ibang-iba - biological identification (ang uri ng HLA ay minana kasama ng mga gene ng magulang), pagpapasiya ng predisposisyon sa iba't ibang sakit, pagpili ng mga donor para sa paglipat ng organ - sa kasong ito, ang mga resulta ng pag-type ng HLA ng donor at mga tisyu ng tatanggap ay inihambing. Gamit ang pag-type ng HLA, natutukoy kung gaano magkatulad o magkaibang mga mag-asawa sa mga tuntunin ng mga antigen ng histocompatibility upang masuri ang mga kaso ng kawalan ng katabaan.

Iminumungkahi ng pag-type ng HLA Pagsusuri ng HLA polymorphism at isinasagawa sa pamamagitan ng dalawang pamamaraan - serological at molecular genetic. Ang klasikong serological na paraan ng pag-type ng HLA ay batay sa isang microlymphocytotoxic na pagsubok, at ang molecular method ay gumagamit ng PCR (polymerase chain reaction).

Serological Pag-type ng HLA isinasagawa sa mga nakahiwalay na populasyon ng cell. Ang pangunahing histocompatibility complex antigens ay pangunahing dinadala ng mga lymphocytes. Samakatuwid, ang isang suspensyon ng T lymphocytes ay ginagamit bilang pangunahing mga carrier ng class I antigens, at isang suspensyon ng B lymphocytes upang matukoy ang HLA class II antigens. Upang ihiwalay ang mga kinakailangang populasyon ng cell mula sa buong dugo, ginagamit ang alinman sa centrifugation o immunomagnetic separation. Ito ay pinaniniwalaan na ang unang paraan ay maaaring humantong sa maling-positibong data, dahil nagreresulta ito sa pagkamatay ng ilang mga cell. Ang pangalawang paraan ay kinikilala bilang mas tiyak - higit sa 95% ng mga cell ay nananatiling mabubuhay.

Ngunit ang batayan para sa pagsasagawa ng lymphocytotoxic test Pag-type ng HLA ay isang tiyak na serum na naglalaman ng mga antibodies sa iba't ibang allelic variant ng HLA class I at II antigens. Maaaring matukoy ng serological test ang uri ng HLA sa pamamagitan ng pagsusuri kung aling sera ang tumutugon sa mga lymphocyte at alin ang hindi.

Kung ang isang reaksyon ay nangyayari sa pagitan ng mga cell at serum, ang resulta ay ang pagbuo ng isang antigen-antibody complex sa ibabaw ng cell. Pagkatapos magdagdag ng solusyon na naglalaman ng pandagdag, nangyayari ang cell lysis at kamatayan. Ang serological HLA typing test ay tinasa gamit ang fluorescence microscopy upang suriin ang positibo (pulang fluorescence) at negatibong (berdeng fluorescence) na reaksyon, o phase-contrast microscopy upang mantsang ang nuclei ng mga patay na selula. Ang resulta ng pag-type ng HLA ay nakuha na isinasaalang-alang ang pagtitiyak ng reacted sera at cross-reacting na mga grupo ng antigens, at ang intensity ng cytotoxicity reaksyon.

Mga disadvantages ng serological Pag-type ng HLA ay ang pagkakaroon ng mga cross-reaksyon, mahinang antibody affinity o mababang pagpapahayag ng HLA antigens, ang kawalan ng mga produktong protina sa isang bilang ng HLA genes.

Mas moderno, mga molecular na pamamaraan Pag-type ng HLA gumagamit sila ng naka-standardized na mga sintetikong sample na hindi tumutugon sa mga antigen sa ibabaw ng mga leukocytes, ngunit sa DNA at direktang nagpapahiwatig kung aling mga antigen ang naroroon sa sample. Ang mga molecular na pamamaraan ay hindi nangangailangan ng buhay na mga puting selula ng dugo; ang anumang selula ng tao ay maaaring pag-aralan, at ang ilang microliter ng dugo ay sapat na upang gumana, o maaari mong limitahan ang iyong sarili sa pag-scrape mula sa oral mucosa.

Molecular genetic Pag-type ng HLA gumagamit ng paraan ng PCR, ang unang hakbang kung saan ay upang makakuha ng purong genomic DNA (mula sa buong dugo, suspensyon ng leukocyte, mga tisyu).

Ang sample ng DNA ay kinokopya - pinalaki sa vitro gamit ang mga primer (maikling single-stranded DNA) na partikular sa isang partikular na HLA locus. Ang mga dulo ng bawat pares ng panimulang aklat ay dapat na mahigpit na pantulong sa natatanging pagkakasunud-sunod na naaayon sa isang partikular na allele, kung hindi ay hindi magaganap ang amplification.

Pagkatapos ng PCR, sa paulit-ulit na pagkopya, ang isang malaking bilang ng mga fragment ng DNA ay nakuha, na maaaring masuri nang biswal. Upang gawin ito, ang mga mixture ng reaksyon ay sasailalim sa electrolysis o hybridization, at kung ang partikular na amplification ay naganap ay tinutukoy gamit ang isang programa o talahanayan. Ang resulta ng pag-type ng HLA ay ipinakita sa anyo ng isang komprehensibong ulat sa mga antas ng gene at allelic. Dahil sa standardisasyon ng mga sample na ginamit, molekular Pag-type ng HLA mas tiyak na serological. Bilang karagdagan, nagbibigay ito ng higit pang impormasyon (higit pang mga bagong DNA alleles) at isang mas mataas na antas ng detalye, dahil pinapayagan ka nitong makilala hindi lamang ang mga antigen, kundi pati na rin ang mga alleles mismo, na tumutukoy kung aling antigen ang naroroon sa cell.

Reaksyon ng immune lysis. Ang reaksyon ay batay sa kakayahan ng mga tiyak na antibodies na bumuo ng mga immune complex na may mga selula, kabilang ang mga erythrocytes at bakterya, na humahantong sa pag-activate ng sistema ng pandagdag sa kahabaan ng klasikal na landas at cell lysis. Sa mga reaksyon ng immune lysis, ang reaksyon ng hemolysis ay kadalasang ginagamit at ang reaksyon ng bacteriolysis ay bihirang ginagamit (pangunahin sa pagkita ng kaibahan ng kolera at tulad ng kolera na vibrios).

Reaksyon ng hemolysis. Sa ilalim ng impluwensya ng isang reaksyon na may mga antibodies sa pagkakaroon ng pandagdag, ang isang maulap na suspensyon ng mga pulang selula ng dugo ay nagiging isang maliwanag na pulang transparent na likido - "lacquer blood" dahil sa pagpapakawala ng hemoglobin. Kapag nagse-set up ng diagnostic complement fixation reaction (CFR), ang hemolysis reaction ay ginagamit bilang indicator: upang subukan ang presensya o kawalan (fixation) ng libreng complement.

Lokal na hemolysis reaksyon sa gel(Erne reaction) ay isa sa mga variant ng hemolysis reaction. Pinapayagan ka nitong matukoy ang bilang ng mga cell na bumubuo ng antibody. Ang bilang ng mga cell na naglalabas ng antibodies - mga hemolysin - ay tinutukoy ng bilang ng mga hemolysis plaque na lumilitaw sa isang agar gel na naglalaman ng mga erythrocytes, isang suspensyon ng mga selula ng lymphoid tissue na pinag-aaralan at pinupunan.

Immunofluorescent na pamamaraan

(RIF, immunofluorescence reaction) ay isang paraan para sa pag-detect ng mga partikular na Ags (Abs) gamit ang Abs (Ags) na pinagsama sa isang fluorochrome. Ito ay may mataas na sensitivity at pagtitiyak. Ginagamit para sa express diagnosis ng mga impeksiyon. mga sakit (pagkilala sa pathogen sa materyal ng pananaliksik), pati na rin para sa pagpapasiya ng Ab at mga receptor sa ibabaw at mga marker ng leukocytes (immunophenotyping) at iba pang mga cell. Direktang I. m. binubuo ng pagproseso ng isang seksyon ng tissue o isang pahid mula sa pathological na materyal o microbial crust na naglalaman ng mga tiyak na Abs conjugated na may fluorochrome; ang paghahanda ay hinuhugasan upang mapalaya ito mula sa hindi nakatali na Abs at sinusuri sa ilalim ng fluorescence microscope. Sa mga positibong kaso, lumilitaw ang isang kumikinang na immune complex sa paligid ng paligid ng bagay. Kinakailangan ang kontrol upang ibukod ang hindi tiyak na luminescence. Sa hindi direkta. I. m. sa unang yugto, ang isang tissue section o smear ay ginagamot sa isang non-fluorescent specific agent, sa pangalawa - na may luminescent agent laban sa -globulins ng hayop na ginamit sa unang yugto. Sa positibong kaso, isang luminous complex ang nabuo, na binubuo ng Ar, At to it at At laban sa At (sandwich method). Bilang karagdagan sa isang fluorescent microscope, ang RIF ay ginagamit upang isaalang-alang ang phenotyping ng mga cell. laser cell sorter .

Daloy ng cytometry- isang paraan ng optical na pagsukat ng mga parameter ng isang cell, ang mga organelle nito at ang mga prosesong nagaganap dito.

Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng pag-detect ng scattering ng liwanag mula sa isang laser beam habang ang isang cell ay dumadaan dito sa isang stream ng likido, at ang antas ng light dispersion ay nagpapahintulot sa isa na makakuha ng ideya ng laki at istraktura ng cell. Bilang karagdagan, isinasaalang-alang ng pagsusuri ang antas ng fluorescence ng mga kemikal na compound na bahagi ng cell (autofluorescence) o idinagdag sa sample bago ang daloy ng cytometry.

Ang cell suspension, na may pre-label na fluorescent monoclonal antibodies o fluorescent dyes, ay pumapasok sa fluid stream na dumadaan sa flow cell. Ang mga kundisyon ay pinili sa paraan na ang mga cell line up ng isa-isa dahil sa tinatawag na. hydrodynamic na pagtutok ng jet sa jet. Sa sandaling tumawid ang isang cell sa laser beam, naitala ng mga detector:

light scattering sa maliliit na anggulo (mula 1° hanggang 10°) (ginagamit ang katangiang ito upang matukoy ang laki ng mga cell).

light scattering sa isang anggulo na 90° (nagbibigay-daan sa amin na hatulan ang ratio ng nucleus/cytoplasm, pati na rin ang heterogeneity at granularity ng mga cell).

ang intensity ng fluorescence sa pamamagitan ng ilang mga channel ng fluorescence (mula 2 hanggang 18-20) - nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang komposisyon ng subpopulasyon ng suspensyon ng cell, atbp.