Лечение генетических заболеваний помощью вирусов. Генная Терапия – Как Работает, Что Лечит, Плюсы и Минусы Проблемы

Здоровье

Концепция замены дефективных генов здоровыми, которая стала активно приобретать научную оболочку еще в начале девяностых годов прошлого века , казалось, подарит надежду самым безнадежным больным. Однако с момента первого эксперимента по генной терапии, осуществленном в 1990-ом году, оптимизма у ученых несколько поубавилось – и все из-за определенных неудач и трудностей в реализации методов генной терапии. Однако возможности, которые предлагает генная терапия для лечения болезни Паркинсона, кистозного фиброза, различных видов рака, и многих других заболеваний, поистине безграничны. Именно поэтому ученые трудятся не покладая рук , стараясь преодолеть все возникающие у них на пути трудности, связанные с генотерапией.

Что такое генотерапия?

Так чем же является генная терапия на самом деле? Для того, чтобы ответить на данный вопрос, необходимо напомнить, что основной функцией генов в нашем организме является регулирование производства белков , необходимых для нормальной работы и здоровья всех клеток. Но некоторые генетические дефекты (изъяны в генах) мешают выполнению их главной функции, в той или иной степени препятствуя выработке белков. Целью же генной терапии (генотерапии) является замена дефективных генов здоровыми . Это поможет наладить воспроизводство соответствующего белка, а значит, человек будет излечен от определенной болезни.

Если рассматривать идеальный сценарий развития, клетки с подкорректированными молекулами дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) начнут делиться, производя, в свою очередь, множественные копии исправленного гена, что позволит организму избавиться от генетической аномалии и полностью излечиться. Однако введение здоровых генов в больные клетки (как и попытки исправить соответствующие отклонения) является крайне сложным процессом, который пока крайне редко приводил к успеху . Именно поэтому большинство современных исследований направлено на разработку безопасных и надежных механизмов введения генов в поврежденные клетки.

Виды генной терапии: терапия ex vivo и in vivo

Генная терапия, в зависимости от способа введения ДНК в геном пациента, может осуществляться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo) . В случае с генной терапией ex vivo, клетки изымаются из организма пациента, генетически модифицируются, а затем вводятся обратно в организм индивидуума. Этот метод особенно полезен в лечении заболеваний крови, так как клетки крови можно довольно легко изъять и ввести обратно. Однако в случае с большинством других заболеваний, изъять клетки из организма и ввести обратно далеко не так просто. К примеру, в случае с заболеваниями сердца, обусловленными генетическими причинами , эффективным мероприятием является так называемая генная терапия in vivo, когда изменения генов осуществляются непосредственно в организме пациента. Для того чтобы проделать данную процедуру, генетическая информация доставляется непосредственно в клетку посредством вектора – молекулы нуклеиновой кислоты, используемой в генной инженерии для передачи генетического материала . В большинстве случаев, для того чтобы осуществить эту передачу, исследователи используют не опасные для здоровья и жизни вирусы.

Способы доставки в клетку генетической информации

Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.

Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.

Сложности, при использовании вирусов в генной терапии

Главная проблема, которая связана со способом доставки генетической информации в клетку посредством вирусов, заключается в том, что полностью проконтролировать соединение генов с клеткой-мишенью чрезвычайно сложно . Это может быть крайне опасно, так как не исключена так называемая экспрессия генов, которая способна превратить здоровые клетки в раковые. На данный момент времени, эта проблема является особенно насущной в работе с ретровирусами. Вторая проблема, решение которой пока невозможно организовать , заключается в том, что одной процедуры применения генной терапии, чаще всего, бывает недостаточно. Большинство генетических терапий необходимо время от времени повторять. И, в третьих, использование вирусов для доставки генетической информации в клетку, осложняется риском возникновения реакции иммунной системы организма. Это также является крайне серьезной проблемой, особенно в тех случаях, когда требуется неоднократное повторение процедуры генной терапии , так как организм пациента постепенно адаптируется и начинает все эффективнее бороться с вводимыми вирусами.

Генная терапия: исследования продолжаются

Если говорить об успехах, то на данный момент времени генетическая терапия является крайне эффективным мероприятием в лечении так называемого комбинированного иммунодефицита , сцепленного с X-хромосомой ген. С другой стороны, случаев успешного использования генотерапии для лечения данной болезни крайне мало. Кроме того, само лечение представляет собой рискованное мероприятие, так как способно вызвать у пациентов ряд симптомов, которые встречаются у людей, страдающих от лейкемии. Помимо данного заболевания, случаев использования генной терапии, которые были бы так же эффективны, очень и очень мало, хотя последние исследования и дают надежду на скорое использование генотерапии для лечения больных, страдающих от артрита, рака мозга, серповидно-клеточной анемии, расщелины сетчатки и от некоторых других состояний.

Получается, что о практическом применении генной терапии в медицине говорить еще очень рано. Тем не менее, исследователи продолжают искать способы безопасного и эффективного использования генной терапии , проведя большую часть экспериментов в живой ткани, перенесенной из организма в искусственную внешнюю среду. Среди этих экспериментов крайне интересными представляются исследования, в рамках которых ученые пытаются ввести в клетку-мишень искусственную, 47-ю хромосому. Недавние научные изыскания позволили ученым лучше разобраться в процессах, происходящих при внедрении молекулы РНК . Это позволило разработать механизм подавления транскрипции гена (так называемое выключение гена), который, возможно, принесет пользу в лечении болезни Гамильтона. Ученые сообщают также о том, что им удалось разработать способ доставки генетической информации в клетки мозга, чего раньше нельзя было осуществить с помощью вектора, так как данная молекула была чересчур велика для этой цели . Иными словами, исследования продолжаются, а это значит, что у человечества есть все шансы научиться бороться с заболеваниями посредством использования методов генной терапии.

30 августа 2017 года Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA) одобрена первая в мире генная терапия рака крови . Речь идет о Kymriah (tisagenlecleucel) компании Novartis Pharmaceuticals, который создан на основе технологии CAR-T и предназначен для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза у детей и молодых взрослых пациентов до 25 лет, рефрактерным к другим методам лечения или имеющим рецидив заболевания.

Использование технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 открывает новые возможности в генной терапии. CRISPR/Cas9 позволяет очень точно и безопасно изменять ДНК клеток. И если совместить технологию CRISPR/Cas9 с доставкой при помощи аденоассоциированных вирусов, то это, по-видимому, позволит системно воздействовать на организм и совершенно безопасно изменять геном очень большого числа клеток.

И вот в 2016 году генетики из университета Дьюка (США) объявили, что им впервые в истории удалось успешно провести генную терапию взрослого млекопитающего (мыши) и вылечить его от генетического заболевания, связанного с дистрофией мышц. Для этого была использована модифицированная версия сравнительно новой технологии редактирования генов CRISPR/Cas9. Технология редактирования генов CRISPR/Cas9 связана с использованием аденоассоциированного вируса, помогающего доставлять генетический материал до места назначения. При помощи этой технологии были проведены успешные опыты по редактированию генов отдельных клеток в пробирках и одноклеточных эмбрионов. К сожалению, пока что возможность генетических манипуляций на эмбрионах человека вызывает ожесточённые споры.

CRISPR/Cas превзошел все ожидания. Он позволила с минимальным числом ошибок как «выключать» нужные гены, так и встраивать новые гены в строго определенные участки генома.

В декабре 2015 года научная группа Фенга Джанга видоизменила данную систему так, что она стала и вовсе безошибочной, что было опубликовано в ведущем научном журнале Science. Ученые заменили 3 аминокислоты «кирпичики», из которых состоит белок) в эндонуклеазе Cas9, после чего число ошибок такой системы свелось практически к нулю.

Использование CRISP/Cas9 особенно актуально для генной терапии старения, где требуется воздействовать на пути долголетия, общие для большинства клеток организма. По генной терапии старения до 2015 года не проведено ни одного клинического испытания на людях, что неудивительно, поскольку старение до сих пор не признано болезнью.

Кроме того, генная терапия старения пока еще очень молодая и развивающаяся область. Сейчас все исследования по генной терапии старения проводятся на модельных мышах, крысах, обезьянах и клеточных культурах человека - клетках в пробирке.

Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где вводятся малые РНК, «выключающие» ген или путь старения. То есть в первом случае вводится нечто полезное для долголетия, а во втором - отключается вредное. В строгом смысле исследований по генной терапии старения на млекопитающих до 2015 года было проведено только два.

Гораздо больше работ моделируют генную терапию на трансгенных мышах. В таких исследованиях терапевтический ген не доставляют в организм взрослой мыши, а при помощи генной инженерии создают мышей, геном которых изменен с рождения. Как и генная терапия, это позволяет исследовать, как увеличение или снижение активности разных генов влияет на продолжительность жизни и старение организма.

Давайте рассмотрим, что можно теоретически сделать с помощью генной терапии и генной инженерии для борьбы со старением.

Преимущество генной терапии перед другими способами продления жизни

Зачем нам генная терапия, если можно использовать препараты от старения (геропротекторы)? В сравнении с другими подходами к продлению жизни (например, геропротекторами или ограничением питания , продлевающими жизнь до 30-50%) генную терапию достаточно провести только один раз за всю жизнь, а таблетки нужно пить всё время и не забывать - иначе и результат будет не полным. Например, в работе Андржея Бартке 2001 года ограничение питания продлило жизнь мышам на 30% . Однако мыши употребляли низкокалорийную диету до 670 дней подряд - то есть каждый день, в течение половины своей жизни! Для большинства людей - это мало реально. А в эксперименте по генной терапии Марии Бласко (будет рассмотрено дальше в этой статье) 2012 года генная терапия теломеразой привела к немного меньшему эффекту - мыши стали жить дольше на 20%. Однако в этой работе мыши получили только 1 инъекцию лекарства в кровь за всю жизнь в довольно преклонном возрасте!

Поэтому, если мы говорим о трансляции исследований по продлению жизни на человека, то генная терапия имеет абсолютное преимущество, поскольку не снижает качество жизни из-за необходимости постоянного лечения - соблюдать ежедневно определенную диету или же постоянно употреблять геропротекторы или другие лекарства. Также генная терапия высокотаргетна и поэтому имеет потенциал к меньшему числу побочных эффектов.

Кроме того, лекарственные средства имеют ограничения по биодоступности в различные ткани и органы.

Внедрение гена теломеразы (TERT) у двухлетних мышей дикого типа (40-50 лет по человеческим меркам) с помощью одной инъекции увеличивает длину теломеров и продлевает им жизнь на 20%.

Ученый предположил, что в клетках существует некий счетчик делений, ограничивающий их общее число. Спустя 10 лет российским ученым Алексеем Оловниковых был предложен гипотетический механизм работы этого счетчика.

Оловников предположил, что при делении клеток концы хромосом, называемые теломерами, немного сокращаются. А когда теломеры достигают критической длины, клетка перестает делиться и стареет. В дальнейшем Элизабет Элен Блэкбёрн - американский учёный-цитогенетик, стала лауреатом Нобелевской премии по физиологии или медицине за 2009 год совместно с Кэрол Грейдер и Джеком Шостаком с формулировкой «за открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы» по теории, в 1971 году предложенной Алексеем Оловниковым.

В нестареющих клетках (например, половых и эмбриональных стволовых), напротив, должен существовать фермент, который удлиняет теломеры, позволяя клеткам делиться практически до бесконечности. Кроме того, было показано, что повреждение гена теломеразы сильно сокращает жизнь модельных животных и приводит к возникновению синдрома преждевременного старения - прогерии.

После открытия теломеразы десятки ученых загорелись тем, чтобы сделать на ее основе лекарство от старости. Казалось бы, «включение» теломеразы во всех клетках может сделать организм бессмертным. Однако вскоре возникли опасения в связи с тем, что активный синтез теломеразы наблюдается и в 90% раковых опухолей. Встал вопрос: не приведет ли активация теломеразы к риску злокачественной трансформации?

Кроме того, оказалось, что старение клеток далеко не всегда сопровождается сокращением теломер. Например, в случае эпителиальных клеток слизистой полости рта или роговицы глаза человека. Это говорило о том, что одной активации теломеразы может быть недостаточно для омоложения всего организма. Перед тем как перейти к генной терапии, эффекты теломеразы исследовались на трансгенных мышах. Оказалось, что если «включить» ген TERT во всех клетках мыши, то продолжительность жизни увеличивается на 40%! Однако постоянная активность теломеразы увеличивала и риск рака. Поэтому стал вопрос о том, как активировать работу теломеразы на более короткий срок.

Именно это было сделано в работе Марии Бласко 2012 года (см. график). Ген теломеразы доставлялся в организм мыши при помощи аденоассоциированного вируса (AAV9), способного обеспечивать системную доставку. Аденоассоциированные вирусы характеризуются высокой безопасностью: они не встраивают доставляемый ген в геном хозяина, и поэтому не приводят к мутагенезу (нет риска рака). Кроме того, они почти не вызывают иммунный ответ. При этом, терапия геном TERT оказалась совершенно безопасной: риск рака у мышей не увеличивался. Двухлетним мышам делалась одна инъекция, с аденовирусом, к которому вставлен ген теломеразы. Это продлевало жизнь мышам на 20 % (как показано на графике выше). А это теоретически может позволить сделать людям в возрасте 40-50 лет одну инъекцию такого лекарства и продлить жизнь ещё на 8-12 лет.

Сегодня простимулировать теломеразу можно и лекарствами. Интересное исследование в этой области провели ученые из Университета Любляны (Словения) в 2016 году после ряда успешных клинических испытаний по омоложению сосудов низкими дозами валсартана и флувастатина. На этот раз они измерили активность теломеразы после омоложения сосудов в образцах крови 130 пациентов пациентов.

Так одномесячный курс существенно повышает активность теломеразы в 3.28 раза , которая достоверно коррелирует с улучшением эндотелиальной функции (омоложением сосудов) и снижением воспаления в кровеносных сосудах. И этот повышенный уровень теломеразы сохраняется, постепенно снижаясь, ещё полгода. Но насколько эффективно такое повышение теломеразы влияет на теломеры ещё предстоит определить.

Важно знать, что теломеры не обязательно могут продлить нам жизнь, если подобную терапию делать не в нужный момент и слишком долго.

К тому же одна лишь стимуляция теломеразы может не удлинить теломеры. Активность теломеразы с возрастом почти не меняется - вот посмотрите график слева. А теломеры всё равно сокращаются.

Также сегодня есть на рынке препарат, который повышает активность теломеразы - ТА-65. Он очень дорогой, а жизнь мышей никак не продлевал в исследованиях. Вот смотрите график слева. В исследовании 2011 года ученые из Испанского Национального Онкологического Центра начали давать долгоживущим двух летним мышам ТА-65 для повышения теломеразы, как и в предыдущем исследовании. Только в предыдущем исследовании мышам делали инъекцию для генной терапии. Но препарат ТА-65 никак не продлил жизнь мышам в отличие от генной терапии (см. график слева) и оказался абсолютно бесполезным для продления жизни и замедления старения.

В 2011 году ученые из Техасского Университета исследовали теломеры и теломеразу в культурах клеток более 60 видов млекопитающих . Роль теломер в долголетии оказалось не так очевидна… Исследования показывают (при сравнении около 60 видов млекопитающих), чем длиннее теломеры у вида, тем быстрее накапливаются у него мутации ДНК, больше раковых опухолей и короче продолжительность жизни. Длина теломер обратно коррелирует с продолжительностью жизни. Это даёт основания предполагать, что результат по продлению жизни теломеразой, который был получен на мышах с помощью одной инъекции, может не продлить жизнь людям. Вопрос по теломерам для людей остаётся открытым.

Вывод: В будущем теоретически мы сможем с помощью внедрения гена теломеразы (TERT) в возрасте 40-50 лет с помощью одной инъекции увеличивать длину теломеров, но одной такой терапии явно недостаточно. Быстрее всего, мы должны найти сочетание генотерапевтических воздействий, чтобы существенно продлить жизнь человека. Сегодня мы можем имитировать эффект с помощью одномесячной терапии 1 раз в полгода комбинацией препаратов валсартана 20 мг + флувастатина 10-20 мг , либо телмисартан + аторвастатин 10 мг. По крайне мере эти препараты в комбинации способны стимулировать саму теломеразу.

Нарушение работы гена Agtr1a, кодирующего рецепторы ангиотензина AT1a продлевает жизнь трансгенным мышам на 26% в сравнении с мышами дикого типа.

Антагонисты рецепторов ангиотензина II, или блокаторы АТ1-рецепторов - одна из новых групп антигипертензивных средств (лекарства для лечения артериального давления). К таким лекарствам можно отнести все лекарства группы сартанов (например, телмисартан) .

Каплан на примере приматов показал, что если собрать группу самцов приматов, то в течение скольких-то дней у обезьян появится социальная иерархия. Самое худшее место в такой иерархии - это внизу. Самцы приматов, находящиеся в подчиненном положении, демонстрируют ряд показателей хронического стресса. Часто у них возникает атеросклероз. Когда учёные давали самцам приматов, находящимся внизу социальной иерархии (группа риска), бета-блокатор пропранолол , подавляющий активность симпатической нервной системы, то атеросклероз сосудов не развивался.

Оказалось, что симпатическая нервная система из-за стресса негативно влияет на развитие атеросклероза и участвует в проблемах с сердцем и сосудами. Эмоциональный стресс реализует себя через симпатическую (адренергическую) автономную нервную систему, которая связывает управляющие центры нашего мозга и внутренние органы. В том числе - с иммунными, костным мозгом и др. Атеросклероз - главный фактор, который приводит к наибольшему число смертей в развитых странах от инфаркта сердца и инсульта мозга.

Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование 1983 года , организованное Goldstein S и коллегами, показало, что терапия пропранололом у 3837 пациентов с острым инфарктом миокарда снижает смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (причина смертности №1 в мире).

В марте 2017 года, французские ученые сообщили об успешных клинических исследованиях генной терапии для лечения серповидноклеточной анемии.

Комитет Американской Национальной Академии наук и Национальной Академии медицины дал поддержку редактирования генома человеческих эмбрионов уже в 2017 году . Но только для серьезных заболеваний и под строгим контролем.

Выводы

1. Все подходы к генной терапии старения делятся на те, где в организм доставляется ген долголетия, и на те, где «выключается» ген или путь старения.

2. В сравнении с другими подходами к продлению жизни генную терапию достаточно провести только один раз за всю жизнь.

3. Внедрение гена теломеразы (TERT), нарушение работы гена Agtr1a, нокаут GHRKO, нарушение в генах, кодирующих рецепторы к IGF-1, сверх экспрессия FGF21, нокаут AC5, удаление RIP3, редактирование гена PCSK9, сверх экспрессия Klotho, нокаут RAGE, сверх экспрессия BubR1, сверх экспрессия MTH1 - всё это примеры самых эффективных способов генной инженерии или генной терапии, позволяющих продлевать жизнь животным.

4. Чтобы добиться более существенных результатов в генной терапии старения и в генной инженерии против старения, необходимо комбинировать разные подходы. Добавить метки

Статья на конкурс «био/мол/текст»: «Миша родился 12 февраля здоровым ребенком. Но в 1,5 месяца я стала замечать, что на всех фотографиях малыш занимает одну и ту же позу, как будто его ножки неподвижны. Уже через несколько недель нам поставили диагноз, посочувствовали и посоветовали начать планировать второго, здорового ребенка ». Из-за роковой комбинации генов Миша, как и остальные дети с этим заболеванием, был вынужден всю свою короткую жизнь бороться за каждое движение. Бороться отчаянно, изо всех сил, но в конце концов проиграть. Спинальная мышечная атрофия (СМА ) относится к числу генетических аномалий, перед которыми человечество пока бессильно. Однако успехи генной терапии, за которыми сегодня наблюдает медицинский мир, могут перевести и СМА, и другие тяжелые наследственные патологии в разряд излечимых. Более того - излечимых еще внутриутробно.

Генеральный спонсор конкурса - компания «Диаэм» : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр .

«Книжный» спонсор конкурса - «Альпина нон-фикшн »

Природа ошибается, человек исправляет

Концепция генной терапии элегантна и красива, как все гениальное . Она заключается в доставке с помощью векторных систем здорового генетического материала в клетку с целью заменить им «ошибочные» гены, с которыми сопряжены различные заболевания (рис. 1).

«Биомолекула» уже писала подробно о том, какие возможности открывает генная терапия в лечении рака и наследственных аномалий, в частности, пигментного ретинита .

И если в 80-х годах прошлого века, когда о генной терапии заговорили довольно громко, ее теория многим казалась продолжением сценария ленты «Назад в будущее », то сегодня она стала реальностью, открывающей новые, поистине безбрежные перспективы.

Тем не менее очевидно, что генная терапия имеет ряд ограничений, особенно когда речь идет о наследственных заболеваниях. Прежде всего, патологический процесс в таких случаях может начаться еще внутриутробно. К моменту, когда заболевание, наконец, диагностируют, - а это порой происходит спустя годы после рождения ребенка, - могут развиться необратимые повреждения клеток и органов, что значительно сужает терапевтические возможности или вообще сводит их на нет .

Шанс решить эту проблему появился благодаря современной пренатальной диагностике, которая позволяет обнаружить хромосомные дефекты уже на ранних стадиях беременности. Получив любой фетальный материал с помощью инвазивных методик, можно быстро и достоверно диагностировать генетические заболевания. А в случаях с гемоглобинопатиями необходимость в инвазивных манипуляциях и вовсе отпадает: чтобы их выявить, достаточно исследовать фетальные ДНК, полученные из клеток крови матери .

Современные пренатальные диагностические методики в комбинации с достижениями генной терапии предоставляют уникальную возможность исправить «ошибку» природы и вмешаться в патологический процесс еще до необратимого повреждения клеток. Обеспечить лечение различных заболеваний ребенка в утробе матери или, по крайней мере, сдержать прогрессирование болезни, по всей вероятности, может фетальная генная терапия , или генная терапия плода .

Идея фетальной генной терапии далеко не нова: всего через несколько лет после первой попытки проведения генной терапии у взрослых, в 1994 году исследователи начали всерьез обсуждать применение инновационной методики внутриутробно . Сегодня, когда лечение генетических заболеваний в утробе матери уже практически превратилось из фантастической перспективы в реальность, опубликована масса работ, где подробно изучена фетальная генная терапия и ее преимущества по сравнению с генной терапией взрослых.

Пренатально vs постнатально

Предваряя вопросы о целесообразности внутриутробной коррекции генетической аномалии, сразу же остановимся на преимуществах генной терапии плода по сравнению с постнатальной генной терапией.

Широкие возможности воздействия на органы и системы

Известно, что при многих генетических заболеваниях (к примеру, буллезном эпидермолизе или кистозном фиброзе) бывает довольно сложно повлиять на основные звенья патологического процесса практически сразу после рождения. Коррекция же мутантных генов у развивающегося плода позволяет быстро увеличить популяцию стволовых клеток, обеспечив большой пул трансфицированных клеток и, как следствие, выраженный терапевтический эффект.

Упрощенное производство клинического вектора, переносящего генетический материал

Дозировка вирусного вектора, с помощью которого переносят генетический материал, зависит от массы тела. Благодаря малому размеру плода удается достигнуть гораздо более высокого биораспределения вектора при той же его дозировке, что в ходе генной терапии взрослого. Это позволяет сэкономить и время, и средства. Представить, насколько существенна экономия, помогают простые сравнительные данные: так, плод в 14–16 недель беременности (оптимальный срок индуцирования вектора) весит около 100 г, в то время как средняя масса тела взрослого составляет около 60 кг.

Повышение эффективности терапии за счет неполноценного иммунного ответа

Ряд исследований продемонстрировал, что гуморальный иммунитет к аденовирусам и аденоассоциированным вирусам (AAV) (рис. 2) определенных серотипов, которые обычно используются в качестве векторов, может приводить к неудаче при экспрессии трансгена . Это может стать одним из критических барьеров для успешной трансплантации.

В группу риска попадают около 50% взрослых, имеющих приобретенный иммунный ответ к этим вирусным векторам . Но даже при отсутствии чувствительности введение вектора у взрослых нередко приводит к развитию иммунного ответа, снижающего длительность и уровень трансгенной экспрессии. Так, после внутримышечной инъекции аденовирусного вектора с геном белка дистрофина взрослым мышам с миодистрофией Дюшенна образуются антитела к дистрофину , что сопряжено со значительным снижением эффективности экспрессии. В то же время плод в утробе матери иммунологически незрел, что позволяет доставлять вирусный вектор и трансгенный продукт без ограничения, которое накладывает иммунный ответ .

Очевидные преимущества фетальной терапии по сравнению с постнатальной коррекцией обеспечивают ее более высокую эффективность и целесообразность, особенно при тяжелых, опасных для жизни заболеваниях. Даже в случаях, когда полного излечения достигнуть невозможно, фетальная генная терапия может влиять на патологические звенья заболевания, облегчая его течение и улучшая прогноз. А, следовательно, именно она может стать единственной терапевтической альтернативой прекращению беременности для тысяч семей. Тем более что число заболеваний, которые потенциально могут оказаться под контролем при внедрении генной терапии плода в клиническую практику, поистине огромно.

Перспективы и возможности

Генная терапия плода, предположительно, способна взять под контроль множество опасных патологий. Лишь малая их толика представлена в таблице 1.

Таблица 1. Заболевания, которые могут контролироваться с помощью фетальной генной терапии .

Заболевание	Геннотерапевтический препарат	Целевые клетки и/или орган	Возраст манифестации заболевания	Распространенность	Продолжительность жизни
Кистозный фиброз	CFTR (трансмембранный регулятор)	Эпителиальные клетки дыхательных путей и кишечника	Третий триместр беременности	1:4000	Около 35 лет
Мышечная дистрофия Дюшенна	Дистрофин	Миоциты	2 года	1:4500	25 лет
Спинальная мышечная атрофия	Белок SMN	Мотонейроны	6 месяцев (тип I)	1:10 000	2 года
Гемофилия	Фактор свертывания крови VIII или IX	Гепатоциты	1 год	1:6000
Бета-талассемия	Глобин	Прекурсоры эритроцитов	До года	1:2700	До 20 лет
Болезнь Гоше	Глюкоцереброзидаза	Гепатоциты	9,5 лет	1:59 000	Менее 2 лет
Дефекты цикла мочевины	Орнитина транскарбамилаза	Гепатоциты	2 дня	1:30 000	2 дня
Буллезный эпидермолиз	Коллаген тип VII	Кератиноциты	Рождение	1:40 000	При корректной терапии нормальная продолжительность жизни
Гипоксическая ишемическая энцефалопатия	Нейротрофические факторы	Кортикальные нейроны	Рождение	1:1000	При корректной терапии нормальная продолжительность жизни
Тяжелая внутриматочная задержка роста	Плацентарные факторы роста	Трофобласт	Плод	1:500	Несколько дней

Кроме того, к числу патологий, которые, предположительно, могут поддаваться контролю с помощью фетальной терапии, относятся :

• Иммунодефицитные расстройства - синдром «голых» лимфоцитов , гипоплазия хряща, синдром Чедиака-Хигаши , хроническая гранулематозная болезнь , синдром Костмана , дефицит адгезии лейкоцитов, синдром Оменна , синдром Вискотта-Олдрича .
• Гемоглобинопатии - резус-болезнь, врожденная эритропоэтическая порфирия.
• Заболевания, сопряженные с дефицитом активности ферментов , - болезнь Гоше, болезнь Краббе , метахроматическая лейкодистрофия , мукополисахаридозы , болезнь Волмана , болезнь Ниманна-Пика .
• Другие - конгенитальный дискератоз , семейный гемафагоцитический лимфогистиоцистоз , инфантильный остеопетроз , синдром Швахмана-Даймонда и др.

Список заболеваний, которые могут оказаться «по плечу» фетальной генной терапии, поражает воображение: предположительно, эта методика позволит вмешаться в ранее неподвластные человеку патологические процессы, обусловленные моногенными заболеваниями. Их количество, по данным Всемирной организации здравоохранения, достигает десяти тысяч . Тем не менее важно учитывать существование ряда ограничений, и в первую очередь рисков для матери и плода, сопряженных с проведением внутриутробной генной терапии.

Страхи и риски

Специфические риски пренатального переноса генов кардинально отличаются от рисков постнатальной генной терапии. Они включают краткосрочные неблагоприятные реакции и долгосрочные постнатальные эффекты. Их актуальность обостряется в связи с тем, что гипотетически экспрессия генов плода может оказывать непредсказуемое действие как на пренатальное, так и на постнатальное развитие .

Прежде всего, непосредственно сама процедура переноса связана с увеличением вероятности выкидыша, хориоамнионита и преждевременных родов. В исследованиях зафиксированы воспалительные реакции на вектор, в частности, инфильтрация печени и некроз печени при фетальной генной терапии овец .

Успех фетальной генной терапии может быть нейтрализован иммунным ответом плода, и это несет определенные риски для конечного результата. Гуморальный и клеточный ответы на введение вектора или трансгенного белка при посредстве трансдукторных систем клеток может элиминировать продукты переноса или нивелировать трансгенную экспрессию. При этом в исследованиях продемонстрирована зависимость силы иммунного ответа от срока гестации. Значительные иммунные реакции на введение лентивирусного вектора на ранних и средних сроках беременности зарегистрированы не были, тогда как при введении аденовирусного вектора на поздних сроках наблюдался мощный гуморальный ответ против капсидного антигена .

Одна из чрезвычайно важных проблем фетальной генной терапии заключается в потенциальном риске, который возникает при передаче плоду донорских последовательностей ДНК. Поскольку векторная интеграция в зародышевые клетки, по всей вероятности, будет носить случайный характер, она теоретически может иметь катастрофические последствия для плода. По сути, ребенок, получивший внутриутробно донорский генетический материал, рождается мутантом. Этическая составляющая генной терапии тревожит умы ученых и богословов. Последние еще со времен рождения самой известной в истории науки овечки предупреждают об опасностях, которые несет человечеству вмешательство в замысел божий.

Еще один важный аспект обусловлен вероятностью мутагенеза в клетках плода, приводящего к дефекту какого-либо функционального гена, что в конечном счете может стать причиной теперь уже нового, приобретенного генетического заболевания или злокачественной опухоли. Ее вероятность выглядит еще более реальной с учетом данных исследования на мышах, в ходе которого экспрессия генов у зародышей мышей дала толчок развитию опухоли печени .

В этом контексте могут оказаться далеко не случайными результаты двух исследований, продемонстрировавших развитие серьезных побочных эффектов после успешной генной терапии Х-сцепленного комбинированного иммунодефицита: в первом случае была зафиксирована манифестация моноклонального лимфопролиферативного заболевания, а во втором - альфа/бета Т-клеточной пролиферации. И в первом, и во втором случаях ретровирусный вектор интегрировался в непосредственной близости от гена LMO2 в пролиферирующих Т-клетках .

Теоретически генная терапия ex vivo может быть более безопасной по сравнению с in vivo фетальным введением вектора. Хотя это и не исключает вероятность мутагенеза в клетках, которые ретровирально трансдуцируются in vitro , введение мутагена можно легче определять и контролировать. Тем не менее полностью исключить эти осложнения, увы, нельзя.

И, наконец, фетальная генная терапия повышает восприимчивость клеток зародыша к трансдукции . Низкоуровневая ретровирусная трансдукция в предшественники зародышевых клеток наблюдалась в мужских и женских гонадах после внутрибрюшинного введения вектора эмбрионам овец и обезьян соответственно . Анализ факторов, приводящих к непреднамеренной трансдукции, показал, что восприимчивость зародышевой ткани к ней зависит от гестационного возраста с более высокими показателями трансдукции на ранней стадии беременности .

С точки зрения потенциальных рисков очевидно, что фетальная генная терапия может быть обоснованным методом лечения только тяжелых генетических заболеваний, других вариантов коррекции которых не существует. И среди них, безусловно, болезнь Гоше, возможность внутриутробной генной терапии которой продемонстрировали в исследовании, опубликованном совсем недавно.

Первый пошел: болезнь Гоше

В июле 2018 года журнал Nature Medicine опубликовал результаты исследования на мышах, проведенного под руководством Симона Уоддингтона (Simon Waddington ) из лондонского Института женского здоровья. Результаты работы продемонстрировали эффективность фетальной генной терапии в лечении нейродегенеративных заболеваний и, в частности, болезни Гоше . Это самая частая форма среди редких наследственных ферментопатий, в основе которой лежит дефицит активности лизосомного фермента глюкозоцереброзидазы (рис. 3), обусловленный мутациями в гене глюкозилцерамидазы . В зависимости от характера мутаций, может развиваться тяжелая нейропатическая форма заболевания, манифестирующая с младенчества, или форма с более постепенным началом и менее выраженными симптомами. В то время как более легкие формы болезни Гоше хорошо поддаются заместительной терапии, тяжелая форма пока остается летальной. Признаки неизлечимой формы болезни Гоше появляются в первые месяцы жизни и включают прогрессирующую мышечную гипотонию, задержку и регресс психомоторного развития и другие неврологические признаки.

В ходе исследования Уоддингтон с соавторами продемонстрировал, что интракраниальное введение аденоассоциированного вирусного вектора 9 (AAV9) эмбриону мышей на 16 день гестации приводило к повышению экспрессии глюкозоцереброзидазы, что останавливало нейродегенерацию. При этом активность фермента в головном мозге была сравнима с таковой у здоровых мышей. Несмотря на то, что у больных грызунов все же диагностировался воспалительный процесс в головном мозге, они развивались достоверно лучше, чем мыши из группы контроля, которых пришлось усыпить через две недели после лечения из-за тяжести заболевания.

Мыши, подвергшиеся фетальной генной терапии, жили, по крайней мере, 18 недель, были фертильными и мобильными. Интересно, что введение вектора постнатально также облегчало течение заболевания, однако было менее эффективным, чем пренатальная экспрессия.

Поскольку AAV9 был способен проникать в мозг из кровотока, команда Уоддингтона провела еще один эксперимент, в ходе которого ввели значительно более высокую дозу вектора не в головной мозг, а непосредственно в кровь зародышей мышей. Мыши после экспрессии были в основном неотличимы от здоровых особей, но, поскольку по условиям эксперимента продолжительность их жизни составила только 55 дней, ученые не смогли сделать выводы о долгосрочной эффективности внутривенной генной терапии.

Эксперимент Уоддингтона стал самой сложной на сегодня работой, в ходе которой была проведена фетальная генная терапия у животных. Сегодня команда работает с корпорацией Apollo Therapeutics , объединившей усилия трех британских университетов и трех крупнейших фармацевтических компаний. Уоддингтон с коллегами преследуют новую цель: на сей раз перед ними стоит задача получить доклинические данные и потенциально протестировать лечение людей. И пока скептики размышляют над кругом возможностей применения фетальной генной терапии у человека, который может значительно сужаться из-за того, что болезнь Гоше не входит в пренатальные тесты, команда Уоддингтона уверенной поступью шагает в будущее. Будущее, где смогут выздоравливать дети с болезнью Гоше, миодистрофией Дюшенна, СМА и многими другими редкими, но сегодня, увы, неизлечимыми заболеваниями.

Литература

1. 12 методов в картинках: генная инженерия. Часть II: инструменты и техники ;
Immune responses to gene therapy vectors: influence on vector function and effector mechanisms . Gene Ther . 11 , S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Immune Response to Full-Length Dystrophin Delivered to Dmd Muscle by a High-Capacity Adenoviral Vector . Molecular Therapy . 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). In Utero Gene Therapy and Genome Editing . Curr Stem Cell Rep . 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology . 22 , 203-218;
5. Сводка с генотерапевтических фронтов. Новая стратегия нейтрализации гемофилии ;
6. Charles Coutelle. (2008). Why Bother?: Is In Utero Gene Therapy Worth the Effort? . Molecular Therapy . 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. al.. (2005). Oncogenesis Following Delivery of a Nonprimate Lentiviral Gene Therapy Vector to Fetal and Neonatal Mice . Molecular Therapy . 12 , 763-771;
8. European Society of Gene Therapy (ESGT) Press release, Bernd Gansbacher. (2003). Report of a second serious adverse event in a clinical trial of gene therapy for X-linked severe combined immune deficiency (X-SCID) . J. Gene Med. . 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. al.. (2018). Fetal gene therapy for neurodegenerative disease of infants . Nat Med . 24 , 1317-1323.

Генная терапия – одна из стремительно развивающихся областей медицины, которая предполагает лечение человека посредством введения в организм здоровых генов. Причем, как утверждают ученые, с помощью генной терапии можно добавить недостающий ген, исправить или заменить его, улучшив тем самым работу организма на клеточном уровне и нормализовав состояние больного.

По словам ученых, потенциальными кандидатами для генной терапии на сегодняшний день являются 200 млн. жителей планеты, причем эта цифра неуклонно растет. И очень отрадно, что несколько тысяч пациентов уже получили лечение от неизлечимых недугов в рамках проводимых испытаний.

В данной статье расскажем о том, какие задачи ставит перед собой генная терапия, какие заболевания можно лечить этим методом и с какими проблемами приходится сталкиваться ученым.

Где применяется генотерапия

Изначально генная терапия была задумана для борьбы с тяжелыми наследственными заболеваниями, такими как болезнь Хантингтона, муковисцидоз (кистозный фиброз) и некоторыми инфекционными заражениями. Однако 1990-й год, когда ученым удалось скорректировать дефектный ген, и, введя его в организм больного, победить муковисцидоз, стал поистине революционным в области генной терапии. Миллионы людей во всем мире получили надежду на лечение заболеваний, которые прежде считались неизлечимыми. И пусть такая терапия находится у самых истоков развития, ее потенциал вызывает удивление даже в научном мире.

Так, например, кроме кистозного фиброза, современные ученые добились успехов борьбе с такими наследственными патологиями, как гемофилия, энзимопатия и иммунодефицит. Более того, лечение генами позволяет бороться с некоторыми онкологическими заболеваниями, а также с патологиями сердца, болезнями нервной системы и даже травмами, к примеру, с повреждениями нервов. Таким образом, генная терапия занимается заболеваниями с крайне тяжелым протеканием, которые приводят к ранней смертности и, зачастую, не имеют другого лечения, кроме терапии генами.

Принцип лечения генами

В качестве действующего вещества врачи используют генетическую информацию, а если быть точным, молекулы, которые являются носителями такой информации. Реже для этого применяют нуклеиновые кислоты РНК, а чаще – клетки ДНК.

Каждая такая клетка обладает так называемым «ксероксом» – механизмом, при помощи которого она переводит генетическую информацию в белки. Клетка, у которой имеется правильный ген и без сбоев работает «ксерокс», с точки зрения генной терапии является здоровой клеткой. У каждой здоровой клетки имеется целая библиотека оригинальных генов, которые она использует для правильной и слаженной работы всего организма. Однако если по какой-либо причине важный ген утерян, восстановить такую потерю не представляется возможным.

Это становится причиной развития серьезных генетических заболеваний, таких как миодистрофия Дюшена (при ней у больного прогрессирует мышечный паралич, и он в большинстве случаев не доживает до 30 лет, умирая от остановки дыхания). Или менее фатальная ситуация. К примеру, «поломка» определенного гена приводит к тому, что белок перестает выполнять свои функции. И это становится причиной развития гемофилии.

В любом из перечисленных случаев на помощь приходит генная терапия, задачей которой является доставить нормальную копию гена в больную клетку и подложить в её в клеточный «ксерокс». В этом случае наладится работа клетки, а может быть, восстановится функционирование всего организма, благодаря чему человек избавится от тяжелого недуга и сможет продлить свою жизнь.

Какие болезни лечит генная терапия

Насколько реально помогает человеку генная терапия? По подсчетам ученых, в мире насчитывается около 4200 заболеваний, которые возникают в результате неправильной работы генов. В этом плане потенциал у данного направления медицины просто невероятный. Однако гораздо важнее то, чего на сегодняшний день удалось добиться медикам. Безусловно, на этом пути хватает трудностей, однако уже сегодня можно выделить ряд локальных побед.

К примеру, современные ученые разрабатывают подходы к лечению ишемической болезни сердца посредством генов. А ведь это невероятно распространенное заболевание, которое поражает гораздо больше людей, чем врожденные патологии. В конечном итоге, человек, столкнувшийся с ишемической болезнью, оказывается в таком состоянии, когда единственным спасением для него может стать генная терапия.

Более того, на сегодняшний день при помощи генов лечатся патологии, связанные с поражением центральной нервной системы. Это такие заболевания, как боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона. Что интересно, для лечения перечисленных недугов используются вирусы, которые имеют свойство атаковать нервную систему. Так, при помощи вируса герпеса в нервную систему доставляют цитокины и факторы роста, замедляющие развитие заболевания. Это яркий пример того, как патогенный вирус, который обычно вызывает болезнь, обрабатывается в лабораторных условиях, лишаясь белков, несущих заболевание, и используется как кассета, которая доставляет в нервы целебные вещества и тем самым действует во благо здоровья, продлевая жизнь человека.

Еще одним тяжелым наследственным заболеванием является холестеринемия, которая приводит организм человека к неспособности регулировать холестерин, вследствие чего в его организме скапливаются жиры, и возрастает риск инфарктов и инсультов. Чтобы справиться с этой проблемой, специалисты удаляют больному часть печени и исправляют поврежденный ген, останавливая дальнейшее накопление холестерина организмом. После этого исправленный ген помещают в обезвреженный вирус гепатита, и с его помощью отправляют обратно в печень.

Читайте также:

Имеются положительные подвижки и в борьбе со СПИДом. Не секрет ведь, что СПИД вызывается вирусом иммунодефицита человека, который разрушает иммунную систему и открывает ворота к организму смертельно опасным заболеваниям. Современные ученые уже знают, каким образом изменить гены, чтобы они перестали ослаблять иммунную систему, а начали укреплять ее для противодействия вирусу. Такие гены вводятся через кровь, посредством ее переливания.

Работает генная терапия и против раковых заболеваний, в частности, против рака кожи (меланомы). Лечение таких пациентов предполагает введение генов с факторами некроза опухоли, т.е. генов, которые содержат противоопухолевый белок. Более того, сегодня проводятся испытания по лечению рака мозга, где больным пациентам вводят ген, содержащий информацию по увеличению чувствительности злокачественных клеток к применяемым препаратам.

Болезнь Гоше представляет собой тяжелейшее наследственное заболевание, которое вызывается мутацией гена, подавляющего производство особого фермента – глюкоцереброзидазы. У лиц, страдающих от этого неизлечимого недуга, увеличена селезенка и печень, а с прогрессированием недуга начинают разрушаться кости. Ученым уже сегодня удались опыты по введению в организм таких пациентов гена, содержащего информацию по выработке данного фермента.

А вот еще один пример. Не секрет, что ослепший человек на всю оставшуюся жизнь лишается возможности воспринимать зрительные образы. Одной из причин врожденной слепоты считается так называемая атрофия Лебера, которая, по сути, является генной мутацией. На сегодняшний день ученые вернули 80 слепым людям зрительные способности, посредством модифицированного аденовируса, который доставил «рабочий» ген в ткани глаза. К слову, несколько лет назад ученым удалось вылечить дальтонизм у подопытных обезьян, путем внедрения в сетчатку глаза животного здорового человеческого гена. А совсем недавно такая операция позволила вылечить дальтонизм первым пациентам.

Что характерно, метод доставки генной информации при помощи вирусов является самым оптимальным, так как вирусы сами находят свои цели в организме (вирус герпеса обязательно найдет нейроны, а вирус гепатита – печень). Однако у данного метода доставки генов есть существенный недостаток – вирусы иммуногены, а значит, при попадании в организм могут быть уничтожены иммунитетом до того, как успеют сработать, а то и вызовут мощные иммунные ответы организма, лишь ухудшив состояние здоровья.

Существует и другой способ доставки генного материала. Это кольцевая молекула ДНК или плазмида. Она отлично спирализуется, становясь очень компактной, что позволяет ученым «упаковать» ее в химический полимер и внедрить в клетку. В отличие от вируса, плазмида не вызывает иммунной реакции организма. Однако этот способ менее подходящий, т.к. спустя 14 дней плазмида удаляется из клетки и продукция белка останавливается. То есть, таким способом ген необходимо вводить на протяжении длительного времени, пока клетка будет «выздоравливать».

Таким образом, у современных ученых есть два мощных метода доставки генов к «больным» клеткам, причем использование вирусов выглядит более предпочтительным. В любом случае окончательное решение по выбору того или иного метода выбирает врач, исходя из реакции организма пациента.

Проблемы, с которыми сталкивается генотерапия

Можно сделать определенный вывод о том, что генная терапия – малоизученная область медицины, которая сопряжена с большим количеством неудач и побочных эффектов, и в этом ее огромный недостаток. Однако есть еще и этический вопрос, ведь многие ученые выступают категорически против вмешательства в генетическое строение человеческого организма. Именно поэтому, сегодня существует международный запрет на использование в генотерапии половых клеток, а также доимплантационных зародышевых клеток. Сделано это для того, чтобы предотвратить нежелательные генные изменения и мутации у наших потомков.

В остальном же, генная терапия не нарушает никаких этических норм, ведь она призвана бороться с тяжелыми и неизлечимыми заболеваниями, в которых официальная медицина попросту бессильна. И в этом самое главное преимущество лечения генами.
Берегите себя!

Первая часть (до синей линии) это введение в генотерапию, в принципе, чтобы лучше понять сами методы, и, чуть что, не быть словленным преподавателем. Если нету времени и нужен КОНКРЕТНО материал по вопросу, пролистывайте сразу за синюю линию.

Генная терапия первоначально нацеливалась на лечение моногенных наследственных заболеваний, но затем область её применения расширилась, и она стала рассматриваться как потенциально универсальный подход к лечению всего спектра болезней, включая также инфекционные заболевания, рак, атеросклероз, диабет и ряд других.

«Лечение генов» - исправление дефекта в гене (моногенные болезни) – на уровне соматических и половых клеток – замена мутантного гена на нормальный.

«Лечение генами» - коррекция дефекта путем введения полноценного работающего гена (кДНК).

Сначала немного общей теории:

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

Стратегии коррекции генетических дефектов:

По типу векторной системы:

Вирусная

Преимущества вирусных векторов : трансдукция большого числа клеток; тропизм; устойчивость к лизосомной деградации.

Недостатки вирусных векторов : иммуногенность (со смертельными исходами – адено- и герпесвирусы); потенциальная канцерогенность (ретровирусы).

Невирусная

· Прямая инъекция в клетку, ткань, орган (она же микроинъекция);

· Липофекция (с помощью различных модифицированных липосом (липидных пузырьков с ДНК внутри);

· Электропорация;

· В составе плазмиды;

· Комплексиррованная ДНК(плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками и тд.);

· Генное ружье (ДНК присоединено к золотым частицам, выстреливаемых в ткани пациента);

· Рецептор-опосредованный эндоцитоз.

Преимущества невирусной доставки : относительная безопасность; отсутствие иммунного ответа; простота применения.

Недостатки невирусной доставки : низкая эффективность трансфекции; низкий уровень экспрессии.

Теоритически наиболее радикальным и эффективным способом является замена дефектного гена в половых клетках (фетальная генотерапия), однако есть этические проблемы. На данный момент все геннотерапевтические подходы базируются на генотерапии на уровне соматических клеток.

По механизму действия встраиваемого гена или переносимой молекулы ДНК, генотерапия делится на положительную (восстановление функции гена(через восстановление его работы или вставки новой рабочей копии) или отрицательную – подавления функции гена). Плюс существует подход направленный на усиление иммунного ответа, который используется в основном в генотерапии рака (об этом ниже).

Так же новую ген информацию можно вносить в организм человека, в составе его же предварительно трансформированных in vitro клеток г.з. ex vivo подход. Подход, при котором, ген информация вводится непосредственно в клетки живого человека, называется (внезапно) in vivo, локальное введение в какие-то определенные участки называется in situ. На данный момент существуют успешные прецеденты введения ген информации in utero (в эмбрион), в Великобритании, совсем недавно спасли ребенка от митохондриальной болезни.

Дополнительные генотерапевтические подходы:

· Антисенс ДНК, РНК (+): специфичность, можно исп в любом векторе, неиммунногенные; (-): быстрая деградация в клетке);

· Рибозимы (+): обладают свойствами ферментов – не расходуются, способны к катализу расщепления мишени, в отличие от белков неиммунногенны, индуцируют синтез интерферона; (-): быстрая деградация;

· Трансдоминантные негативные белки;

· Одноцепочечные антитела;

· Суицидные гены (вместо «лечения» клетки, ее можно просто убить, используется в антираковых системах, (подробнее будет ниже);

· Введение антиген-специфичных лимфоцитов;

· Химеропластика (гибриды ДНК/РНК шпилечной структуры, производят гомологичную рекомбинацию в ядре);

Тут идут исключительно примеры генотерапевтических методов, описания заболеваний смотрите в предыдущих по нумеровке билетах.

Моногенные заболевания:

Недостаточность аденозиндезаминазы (АДА синдром) – первый относительно удачный пример использования генотерапии. Она была осуществлена 14 сентября 1990 года. Эта дата считается днем рождения реальной генной терапии.

С помощью лейкофореза из периферической крови выделяли мононуклеарные клетки, затем их растили в культуре в условиях пролиферации Т-клеток. Затем в пролиферирующие в условиях in vitro клетки вводили ретровирусный вектор, который содержал нормальный ген ADA. Через несколько дней трансдуцированные клетки крови вводили обратно пациентке. Процесс повторяли 7 раз на протяжении 10 месяцев. Эффект был положительным, ¼ лифоцитов в организме получили рабочий ген. Раз в 3-5 месяцев введение модифицированных клеток повторяли. В настоящее время генная терапия данного заболевания развивается в направлении использования стволовых клеток пациента. Это позволит значительно сократить количество введений модифицированных клеток за счет их многократных делений уже в самом организме и при достижении селективного и количественного преимущества модифицированных стволовых клеток над нативными сформирует достаточный уровень фермента в организме.

Наследственная гиперхолестеролемия - Известно, что неделящиеся гепатоциты не могут быть инфицированы ретровирусами. После гепатоэктомии гепатоциты начинают пролиферировать и приобретают способность инфицироваться ретровирусами. В гепатоциты, полученные из печени больного, с помощью ретровирусного вектора была введена кДНК гена нормального рецептора LDL-R. После реинфузии рекомбинантных гепатоцитов через воротную вену в печень наблюдалось уменьшение содержания в крови липопротеинов низкой плотности (в частности, холестерина) и соотношения липопротеинов низкой плотности к липопротеинам высокой плотности. Это означает, что введенные клетки функционировали in vivo и осуществляли интернализацию и обмен холестеринов.

Гемофилия В – Были проведены успешные опыты на собаках с использованием стратегии ех vivo с
доставкой в гепатоциты кДНК, кодирующей фактор IX. Удалось добиться синтеза фактора IX в количествах, составляющих 0,1% от нормального количества фактора IX в плазме крови. При попытке повысить концентрацию фактора IX были использованы аденовирусные векторы, однако эффект был недолговременным. Кровь животных свертывалась, однако эффект полностью пропадал после 2х месяцев (типичный недостаток аденовирусных векторов).

Гемофилия A - Появились сообщения об успешном введении мышам укороченного гена фактора VIII в составе ретровирусного вектора. В результате достигается терапевтический уровень фактора в крови.

Муковисцидоз - Показано, что замена 6-10% клеток легочного эпителия трансфецированными клетками позволит восстановить нормальные транспортные функции трансмембранных каналов, обеспечивающих перенос ионов хлора. Ретровирусы не подходят, так как не ифицируют неделящиеся клетки, аденовирусы подходят с оговорками, так как в опытах на мышах вызывали воспалительные реакции. Проблема дополнительно заключается в барьере из гликокаликса на поверхности клеток. Один из подходов для решения данной проблемы заключается в модификации вектора, который включает в себя определенный лиганд к рецептору на поверхности клеток легочного эпителия. Взаимодействие лиганда с рецептором обычно приводит к интернализации вектора вместе с рецептором внутрь клетки. В качестве такого рецептора был выбран трансмембранный рецептор P2Y2-R. Этот рецептор участвует в запуске каскада воспалительных реакций в полости легких. В качестве лиганда использовались либо моноклональные антитела к этому рецептору, либо природный лиганд - биотинУТФ.

Мышечная дистрофия Дюшена - Болезнь начинает проявляться в детстве, и генная терапия должна проводиться в это же время. Наиболее перспективным является использование аденовирусных векторов. Из-за большой длины гена, исследователи используют укороченные, но функциональные копии белка. ксперименты на мышиных моделях, которые имеют дефектный ген дистрофина, показали, что от 5 до 50% мышечных клеток экспрессировали усеченный белок дистрофин. Этого было достаточно для сведения к минимуму мышечной дегенерации. Существуют данные о клинических испытаниях генетической конструкции, несущей ген дистрофина, для терапии больных мышечной дистрофией Дюшена. Больные дети после инъекции в мышцы такой конструкции приобретали способность двигаться. Однако, эффект был кратковременным.

Многофакторные заболевания на примере онкологических заболеваний:

Рак это, как правило, следствие многоступенчатых изменений клетки. Сложность, связанная с участием множества генов и их продуктов в опухолевом процессе, вызывала сомнения в эффективности генной терапии раковых заболеваний. Однако, существуют многочисленные эксперименты, показывающие, что компенсация единственного гена-супрессора может приводить к подавлению опухолевых свойств клеток.

Иммунотерапия рака:

Использование генотерапевтических конструкций, стимулирующих иммунный (в основном клеточный) противоопухолевый ответ. Для создания ген-конструкций используют гены: Антигенов (на который срабатывает иммунная система); Комплекса MHCI(главный комплекс гистосовместимости); фактора B7; Цитокинов; Рецепторов Т-клеток. Подавление развития опухоли может быть достигнуто клонированием генов цитокинов: интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, а также фактора некроза опухолей –α (TNF- α), интерферонов (INF- α, INF-ϒ)

Подавление роста раковых клеток введением в них генов, продукты которых подавляют развитие опухоли:

· Гены-супрессоры опухоли (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)

· Суицидные гены

· Ингибиторы онкогенов

· Факторы антиангиогенеза

· Ингибиторы циклинов

· Гены, повышающие чувствительность клеток опухоли к лекарственным соединениям

· Гены транспортеров лекарственных соединений (введение, например, в клетки костного мозга)

Колоссальное значение имеет в подавлении онкогенов ген p53(отвечает за апоптоз и способен остановить клеточный цикл, предотвращая бесконтрольное деление), поэтому его мутация практически всегда ведет в злокачественному перерождению клетки. Для внесения рабочей копии гена p53 в организм используются аденовирусные вектора. После начала экспрессии гена p53 в ядре раковой клетки, он индуцирует ее апоптоз.

Другим подходом является подавление работы онкогенов . Мутация в гене RAS способна привести к конститутивной работе сигнальной системы запуска деления (MAP киназный каскад, вспоминаем Николайчика J). Чтобы заблокировать этот ген, можно 1)ингибировать экспрессии RAS введением интактного гена; 2)ингибирование RAS рибозимами; 3)ингибирование нижележащих в сигнальном пути генов; 4)препятствие встраивания RAS белка в мембрану.

Использование онколитических вирусов. Вирусный онколизис - это принципиально новый подход к терапии онкологических заболеваний, основанный на естественной способности вирусов убивать (лизировать) клетки, в которых он размножается. Для этого используются реовирусы, полиовоирусы, эховирусы и вирусы Коксаки + некоторые модифицированные аденовирусы, которые преимущественно размножаются в опухолевых клетках и ведут их к апоптозу. В настоящее время проводятся клинические испытания препарата REOLYSIN, выпускаемого компанией Oncolytic Biotech. Очень перспективными считаются аденовирусы, экспрессирующие антиангиогенные белки.